堿裂解法提取質粒實驗技術分析

堿裂解法提取質粒實驗技術分析

[實驗原理]

羊源性成分核酸檢測PCR-熒光探針試劑盒堿裂解法提取質粒是根據共價閉合環狀質粒DNA與線性染色體DNA在拓撲學上的差異來分離它們。在pH值介于12.0~12.5這個狹窄的范圍內,線性的DNA雙螺旋結構解開而被變性,盡管在這樣的條件下,共價閉環質粒DNA的氫鍵會被斷裂,但兩條互補鏈彼此相互盤繞,仍會緊密地結合在一起。當加入pH4.8的乙酸鉀高鹽緩沖液恢復Ph至中性時，共價閉合環狀質粒DNA的兩條互補鏈仍保持在一起，因此復性迅速而準確，在而線性的染色體DNA的兩條互補鏈彼此已完全分開，復性就不會那么迅速而準確，它們纏繞形成網狀結構，通過離心，染色體DNA與不穩定的大分子RNA、蛋白質-SDS復合物等一起沉淀下來而被除去。

[實驗儀器與設備]

1.恒溫培養箱 2.恒溫搖床

3.臺式離心機(zui大轉速4000rpm) 4.冷凍高速離心機

5.高壓滅菌鍋 6.超凈工作臺

7.微量移液器 8.eppendorf tupe、tip

[實驗材料]

1.葡萄糖 2.三羥甲基氨基甲烷(Tris)

3.乙二胺四乙酸(EDTA) 

4.十二烷基硫酸鈉(SDS) 5.乙酸鉀

6.冰乙酸 

7.乙醇 8.胰RNA酶

11.羊源性成分核酸檢測PCR-熒光探針試劑盒氨芐青霉素 12.蔗糖

13.溴酚藍 14.酚

15.β巰基乙醇 16.鹽酸

17.含pUC18質粒的大腸桿菌

附：試劑的配制

1.溶液Ⅰ

50mmol/L 葡萄糖

5mmol/L 三羥甲基氨基甲烷(Tris) Tris·HCl (pH8.0)

10mmol/L 乙二胺四乙酸(EDTA)(pH8.0)

2.溶液Ⅱ

0.4 mol/L NaOH, 2%SDS, 用前等體積混合

3.溶液Ⅲ

5mmol/L 乙酸鉀 60 ml

冰乙酸 11.5 ml

水 28.5 ml

4.TE緩沖液

10mmol/L Tris·HCl

1 mmol/L EDTA(pH8.0)

5.70%乙醇(放-20℃冰箱中,用后即放回)

6.胰RNA酶

將RNA酶溶于10mmol/L Tris·HCl(pH7.5)、15mmol/L NaCl中，配成10mg/ml的濃度，于100℃加熱15min,緩慢冷卻至室溫，保存于-20℃。

7.終止液:40%蔗糖、0.25%溴藍酚

8.酚

[實驗步驟]

(一) 提取質粒

1.將2ml含相應抗生素的LB液體培養基加入到試管中，接入含質粒的大腸桿菌，37℃振蕩培養。

2.取1.5ml培養物倒入微量離心管中，4000rpm，離心2min。

3.吸去培養液，使細胞沉淀盡可能干燥。

4.將細菌沉淀懸浮于100μl溶液Ⅰ中，充分混勻，室溫放置10 min。

5.加200μl溶液Ⅱ(新鮮配制)，混勻內容物，將離心管放冰上5 min。

6.加入150μl溶液Ⅲ(冰上預冷)，蓋緊管口，顛倒數次使混勻。

7.1200rpm，離心15 min，將上清轉至另一離心管中。

8.向上清中加入等體積酚：反復混勻，12000rpm，離心5min,將上清轉移到另一離心管中.

9.羊源性成分核酸檢測PCR-熒光探針試劑盒向上清加入2倍體積乙醇,混勻后,室溫放置5-10min。12000rpm離心5min。倒去上清液，把離心管倒扣在吸水紙上，吸干液體。

10.用1ml70%乙醇洗滌質粒DNA沉淀，振蕩并離心，倒去上清液，真空抽干或空氣中干燥。

11.加50μl TE緩沖液，其中含有20μg/ml的胰RNA酶，使DNA完全溶解，-20℃保存。