第二代測序（NGS）技術

　　二代測序是一個強大的功能平臺，它可以同時給數以萬計的DNA分子進行測序。由于這種可以多個樣本同時測序的能力，在個性化醫療、遺傳疾病和臨床診斷等方面，二代測序也就是高通量測序開創了革命性的領域。

　　早在1900年代就發明的Sanger測序法，成為了DNA測序的黃金法則，即便到了今天它仍被廣泛用來進行常規測序和NGS數據的驗證。它利用高保真DNA聚合酶生成與單鏈DNA模版互補的拷貝。在每個反應中，一個可以特異性識別模版的單鏈引物，可以從3端開始啟動DNA合成，根據堿基互補配對原則，脫氧核糖核苷酸或簡單的核苷酸是一個接一個的與模版配對。

　　每個反應還包含四種雙脫氧核糖核苷酸的混合物，每一種對應一個DNA堿基。這些雙脫氧核糖核苷酸與DNA單體十分類似，因此可以參與DNA鏈的增長，但是他們和天然的脫氧核糖核苷酸有兩點不同：

　　（1）他們缺少一個會影響DNA鏈進一步衍生的3’羥基。在DNA延伸過程中，這個3’羥基一旦加入DNA分子中就會導致鏈的終止；

　　（2）每個雙脫氧核糖核苷酸都有獨特的熒光染料吸附，使得DNA測序的自動檢測得以進行。

　　于是，每個反應會產生許多不同長度的DNA片段，并在模版的任一核苷酸位置上由其中一種雙脫氧核糖核苷酸終止鏈的延伸。反應混合物可以通過手動灌膠或自動灌膠到用毛細管進入測序機器，再根據DNA分子大小不同用電泳分離DNA。當DNA流過凝膠后，DNA序列可以通過雙脫氧核糖核苷酸上發出的熒光來進行分析。當今的Sanger測序儀使用的是毛細管自動上樣的凝膠電泳，一般可以同時分析8-96個系列反應。

　　二代測序系統在十年前就是因其可同時進行大量平行測序反應而廣為人知。這些系統可以同時分析百萬甚至上億個序列反應。雖然不同的機器生產時會在技術細節上有許多不同，但他們都有以下幾個共同點：

　　1,文庫建立：所有二代測序的平臺都需要一個基因文庫，這個基因文庫包含通過引申或者連接自定義的接頭序列。

　　2,測序儀器：每個文庫片段在共階吸附的DNA連接因子的作用下，以文庫適配序列為模版，在固體表面上進行擴增。這步擴增會產生許多DNA蔟，每個來源于一個文庫片段，每個基因蔟都會像獨立的測序反應一樣起作用。

　　3,數據輸出：每個儀器都會在測序結束后給出原始數據。這個原始數據時每個基因蔟中形成的DNA序列的集合。

　　不同的二代測序平臺的區別主要體現在測序反應的技術上，這些差別可以分為4類：

　　焦磷酸測序，合成法測序，連接法測序和離子半導體測序。

　　焦磷酸測序

　　在焦磷酸測序中，測序反應通過每個核苷酸結合過程中釋放的焦磷酸來調控。釋放的焦磷酸參與了一系列化學反應從而導致鏈光的產生。發出的光由記錄基因蔟相應序列的相機來檢測。測序反應開始后，先一次孵育一個堿基，測量光發射情況（如果有的話），在降解未參與反應的堿基，最后加入另一個堿基。這項技術能夠產生較大的讀取長度，已經可以與Sanger測序法得到的讀取長度相比較。然而，高昂的試劑花費，和有6個或以上的均聚物會產生的高錯誤率阻礙了這個技術的應用。

　　合成法測序

　　合成測序法是使用可逆熒光和終止核苷酸的分步整合的方法進行DNA測序，并已被ll lumina NGS平臺使用。首先在測序芯片中同時加入四種核苷酸，核苷酸結合之后，剩余的DNA堿基就會被洗滌去除。每個基因蔟中熒光信號被讀取和記錄之后，這個過程一直重復直到測序反應完成。這個系統能通過一次只結合一個核苷酸來克服焦磷酸測序的缺點。然而，當測序反應進行時，儀器的錯誤率也在增加。這是因為去除不完全的熒光信號會導致更高的背景噪聲。

　　連接測序法

　　連接測序法與其他兩種方法不同，因為他不用DNA聚合酶來結合核苷酸，而是用16種8-mer Oligo核苷酸探針，在相互連接的5端，每個探針都吸附了四種熒光染料其中的一種。每8-mer包含兩個探針特異堿基，和6個退化堿基。測序反應開始時，引物先結合到適配序列上，再和相應探針結合。這個探針的結合時在退火條件下由兩個探針特異堿基引導，再由DNA連接酶連接到引物序列上。未結合的oligo核苷酸被洗去后，熒光信號就開始檢測會記錄。在這之后，切割掉熒光信號和8-mer探針的最后3個堿基，就可以開始下一個循環了。在大約7個循環的連接之后，DNA會變性，而另一個測序引物，在前一個引物的下一個堿基后開始重復這些步驟，總共用5個測序引物。這項技術的主要缺點就是產生的測序片段特別短。

　　離子半導體測序

　　離子半導體測序法時在測序反應種通過釋放氫離子來檢測一個基因蔟的序列。每個基因蔟直接定位在一個半導體三極管上，這個半導體三極管可以檢測溶液的ph值。在核苷酸結合過程中，一個氫離子被釋放到溶液中并會被半導體三極管檢測到。這個測序反應的進行過程和焦磷酸法類似，但是花費只是他的幾分之一。

　　為了展現并比較以上幾種測序方法技術方面的不同，給所有人，鼠，擬南芥和大腸桿菌基因組測序時，每個測序產生的覆蓋數量都會在這里計算和展示。展示的數據都是來自于每種技術強大的儀器。全基因組測序時，為使數據有效，最少需要30x的覆蓋面。就像大家看到的，焦磷酸測序法只能給大腸柑橘基因組測序，并且需要足夠的覆蓋面來產生有效的數據。