目前,體液標志蛋白的檢測方法主要采用免疫學方法,以酶聯免疫吸附測定(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)、放射免疫測定(Radio immunoassay,RIA)和膠體金層析法(俗稱“金標”)這幾種方法為主。ELISA方法雖然在臨床上使用了近二十年,但它依然存在一些致命缺點,定量準確性差、操作時間長、自動化程度低,一般只能用于定性檢測。RIA靈敏度高,但不穩定,重復性比ELISA差,而且存在放射性污染的危險。金標方法雖然穩定性較好,但靈敏度較低,只能定性,不能定量。特別是重復性差這一缺點限制了這些檢測技術在臨床上的應用,尤其不適合用于需要通過準確定量來幫助對疾病進行診斷的體液標志蛋白的定量檢測。因此,尋找更加穩定、準確的血漿蛋白定量檢測方法一直是國際上近十年來的研究熱點。
膠乳顆粒增強比濁法(particle-enhanced turbidimetric immunoassay, PETIA )是近年來出現的一種較為穩定、準確的體液蛋白均相免疫比濁檢測方法。PETIA法大體分為兩種。一種是散射比濁檢測法;另一種是透射比濁檢測法。這兩種方法的基本原理非常相似,都是在高分子膠乳微球的表面交聯單克隆抗體,當交聯有抗體的微球與抗原結合后,在短時間內會迅速聚集在一起,改變了反應液的散光性能或透光性能。而且,反應液散光性能或透光性能(即吸光度)的改變與被測抗原的濃度有較強的相關性,在一定范圍內可以反映被測抗原的濃度。PETIA檢測方法是在均相反應體系中進行抗原、抗體反應及結果的測定。抗原、抗體反應后,直接測定反應液的吸光度值,省卻了ELISA法反復孵育和洗板等煩瑣操作步驟,幾分鐘就能獲得結果,省時省力。此外,納米免疫比濁法操作步驟的簡化也相應地避免了許多人為操作因素和試劑、環境等外界因素的干擾,穩定性和重復性都較好,能較真實地反映被測物質的含量。免疫比濁法的靈敏度雖然比ELISA法差一些,但足于檢測到健康人血漿中許多標志蛋白的下限值,可完全滿足臨床檢測要求。但這種方法在國內尚無任何單位有自行研究的報道。
目前,PETIA檢測試劑所采用的乳膠顆粒多為惰性微球和羧基化微球,而且球粒較大(>0.5μm)他們對單克隆抗體結合的能力不強,臨床檢測的線性范圍窄,干擾因素多,實驗穩定性差,大大地限制了免疫比濁法在臨床上的廣泛應用。因此,有必要改進高分子乳膠微球表面的化學特性,提高與抗體結合的能力,提高檢測的靈敏度,使免疫比濁檢測方法廣泛適用于臨床上各種特定蛋白的定量檢測。
我公司通過改進高分子納米微球的合成技術,制備氨基化高分子納米微球作為抗體交聯的載體,提高微球與單抗的交聯效率,開發出新一代的體液疾病標志蛋白免疫透射比濁定量檢測試劑,并進行產業化,建立以單克隆抗體交聯高分子納米微球的免疫比濁定量檢測技術平臺,已有三個產品獲得了國家SFDA注冊證,另外兩個產品通過了國家有關部門的檢定。我公司研制的免疫透射比濁定量檢測試劑盒采用氨基化微球作為單抗交聯的載體;氨基化納米微球的顆粒大小較傳統的微球更小(約0.1μm),它與抗體的結合是通過其表面的氨基與抗體的氨基端共價結合,在微球與抗體之間有一個橋聯化學臂,降低了位阻效應,不僅提高了抗體的結合率,而且還為抗體提供合適的三維空間立體結構,有效地保護了抗體與抗原結合的活性區域。與采用惰性納米微球的傳統技術相比,檢測的靈敏度得到了極大的改善,檢測靈敏度最高可達到1.0ng/ml。采用單克隆抗體交聯高分子納米微球免疫比濁定量檢測人體血清蛋白,歸納起來有以下幾個方面的突出優點:(1)操作簡單,可在幾分鐘內快速、準確地檢測血清蛋白含量,真實反映病情進展和評估治療效果,對于疾病的早期診斷和治療具有重要的臨床意義;(2)不易受人為操作和外界因素干擾,檢測穩定性和重復性都很好;(3)能利用普通的生化分析儀進行檢測,容易實現自動化,可在各級基層醫療機構普及和應用。