細胞凋亡檢測實驗——TUNEL法

脫氧核糖核苷酸衍生物地高辛[（digoxigenin）-11-dUTP]在TdT酶的作用下，可以摻入到凋亡細胞雙鏈或單鏈DNA的3-OH末端，與dATP形成異多聚體，并可與連接了報告酶（過氧化物酶或堿性磷酸酶）的抗地高辛抗體結合。在適合底物存在下，過氧化物酶可產生很強的顏色反應，特異準確的定位出正在凋亡的細胞，因而可在普通光學顯微鏡下進行觀察。

毛地黃植物是地高辛的唯一來源。在所有動物組織中幾乎不存在能與抗地高辛杭體結合的配體，因而非特異性反應很低。抗地高辛的特異性抗體與脊椎動物甾體激素的交叉反應不到1%，若此抗體的Fc部分通過蛋白酶水解的方法除去后，則可完全排除細胞Fc受體非特異性的吸附作用。

組織切片冰凍切片細胞

磷酸緩沖液蛋白酶K氯化鈷鹽蒸餾水雙氧水二氨基聯苯丁醇乙醇二甲苯甲醛乙酸松香水抗地高辛抗體氯化鈉檸檬酸鈉乙酸鈉甲基綠TdT酶反應液

光學顯微鏡染色缸載玻片蓋玻片

一、試劑配制

1.  磷酸緩沖液PBS（pH7.4）：磷酸鈉鹽 50 mM，NaCl 200 mM。

2.  蛋白酶K（200 μg/ml，pH7.4）：蛋白酶K 0.02 g；PBS 100 ml。

3.  含2%H₂O₂的PBS緩沖液（pH7.4）：H₂O₂ 2.0 ml；PBS緩沖液 98.0 ml。

4.  TdT酶緩沖液（新鮮配）：Trlzma堿 3.63 g用 0.1 N HCl調節pH至 7.2，加ddH₂O定容到1 000 ml；再加入二甲砷酸鈉 29.96 g和氯化鈷0.238 g。

5.  TdT酶反應液：TdT酶32 μl；TdT酶緩沖液 76 μl，混勻，置于冰上備用。

6.  洗滌與終止反應緩沖液：氯化鈉 17. 4 g；檸檬酸鈉 8.82 g；ddH₂O 1 000 ml。

7.  0.05%二氨基聯苯（DAB）溶液：DAB 5 mg；PBS 10 ml，pH7.4，臨用前過濾后，加過氧化氫至0.02%。

8.  0.5%甲基綠（pH4.0）：甲基綠0.5 g；0.1 M乙酸鈉100 ml。

9.  100%丁醇，100%、95%、90%、80%和70%乙醇，二甲苯，10%中性甲醛溶液，乙酸，松香水等。

10.  過氧化物酶標記的抗地高辛抗體（ONCOR）。

二、實驗步驟

1.  標本預處理

（1）石蠟包埋的組織切片預處理：將組織切片置于染色缸中，用二甲苯洗兩次，每次5 min。用無水乙醇洗兩次，每次3 min。用95%和75%乙醇各洗一次，每次3 min。用PBS洗5 min 加入蛋白酶K溶液（20 ug/ml），于室溫水解15 min，去除組織蛋白。用蒸餾水洗4次，每次2 min，然后按下述步驟2進行操作。

（2）冰凍組織切片預處理：將冰凍組織切片置10%中性甲醛中，于室溫固定10 min后，去除多余液體。用PBS洗兩次，每次5 min。置乙醇：乙酸（2：1）的溶液中，于-20℃處理5 min，去除多余液體。用PBS洗兩次，每次5 min，然后按下述步驟2進行操作。

（3）培養的或從組織分離的細胞的預處理：將約 5 × 10⁷個/ml細胞于 4%中性甲醛室溫中固定10 min。在載玻片上滴加 50-100 μl細胞懸液并使之干燥。用PBS洗兩次，每次5 min，然后按下述步驟2進行操作。

2.  色缸中加入含2%過氧化氫的PBS，于室溫反應5 min。用PBS洗兩次，每次5 min。

3.  用濾紙小心吸去載玻片上組織周圍的多余液體，立即在切片上加2滴 TdT酶緩沖液，置室溫1-5 min。

4、 用濾紙小心吸去切片周圍的多余液體，立即在切片上滴加 54 μl TdT酶反應液，置濕盒中于37C反應 1 h（注意：陰性染色對照，加不含TdT酶的反應液）。

5.  將切片置于染色缸中，加入已預熱到37℃的洗滌與終止反應緩沖液，于37℃保溫30 min，每10 min將載玻片輕輕提起和放下一次，使液體輕微攪動。

6.  組織切片用PBS洗3次，每次 5 min后，直接在切片上滴加兩滴過氧化物酶標記的抗地高辛抗體，于濕盒中室溫反應30 min。

7.  用PBS洗4次，每次5 min。

8.  在組織切片上直接滴加新鮮配制的0.05% DAB溶液，室溫顯色3-6 min。

9.  用蒸餾水洗4次，前3次每次1 min，最后1次5 min。

10.  于室溫用甲基綠進行復染10 min。用蒸餾水洗3次，前兩次將載玻片提起放下10次，最后1次靜置30 s。依同樣方法再用100%正丁醇洗三次。

11.  用二甲苯脫水3次，每次2 min，封片、干燥后，在光學顯微鏡下觀察并記錄實驗結果。

1.  一定要設立陽性和陰性細胞對照。

2.  陽性對照的切片可使用DNaseI部分降解的標本，陽性細胞對照可使用地塞米松（1 μM）處理3-4 h的大、小鼠胸腺細胞或人外周血淋巴細胞。

3.  陰性對照不加TdT酶，其余步驟與實驗組相同。

一、TUNEL法簡介

細胞凋亡中染色體DNA的斷裂是個漸進的分階段的過程，染色體DNA首先在內源性的核酸水解酶的作用下降解為50-300 kb的大片段。然后大約30 ﹪的染色體DNA在Ca²⁺和Mg²⁺依賴的核酸內切酶作用下，在核小體單位之間被隨機切斷，形成180-200 bp核小體DNA多聚體。

DNA雙鏈斷裂或只要一條鏈上出現缺口而產生的一系列DNA的3'-OH末端可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸化酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的3'-末端，從而可進行凋亡細胞的檢測，這類方法一般稱為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（TUNEL）。

由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3'-OH形成，很少能夠被染色。低分子量的DNA分離后，也可使用DNA聚合酶進行缺口翻譯（nick translation），使低分子量的DNA標記或染色，然后分析凋亡細胞。

TUNEL或缺口翻譯法實際上是分子生物學與形態學相結合的研究方法，對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色，能準確的反應細胞凋亡最典型的生物化學和形態特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養的細胞和從組織中分離的細胞的細胞凋亡測定，并可檢測出極少量的凋亡細胞，靈敏度遠比一般的組織化學和生物化學測定法要高，因而在細胞凋亡的研究中已被廣泛采用。