細胞凋亡的檢測方法綜述1

一、形態學檢測
（一）光學顯微鏡和倒置顯微鏡　　
1、未染色細胞
凋亡細胞的體積變小、變形，細胞膜完整但出現發泡現象，細胞凋亡晚期可見凋亡小體。貼壁細胞出現皺縮、變圓、脫落。　　
2、染色細胞
常用姬姆薩染色、瑞氏染色等。凋亡細胞的染色質濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質分割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態。　　
（二）熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡　　
一般以細胞核染色質的形態學改變為指標來評判細胞凋亡的進展情況。
常用的DNA特異性染料有：HO 33342 （Hoechst 33342），HO 33258 （Hoechst 33258）， DAPI。三種染料與　DNA的結合是非嵌入式的，主要結合在DNA的A-T堿基區。紫外光激發時發射明亮的藍色熒光。
Hoechst是與DNA特異結合的活性染料，儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用時用PBS稀釋成終濃度為2~5mg/ml。

DAPI為半通透性，用于常規固定細胞的染色。儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用終濃度一般為0.5 ~1mg/ml。
結果評判：細胞凋亡過程中細胞核染色質的形態學改變分為三期：Ⅰ期的細胞核呈波紋狀（rippled）或呈折縫樣（creased），部分染色質出現濃縮狀態；Ⅱa期細胞核的染色質高度凝聚、邊緣化；Ⅱb期的細胞核裂解為碎塊，產生凋亡小體
（三）透射電子顯微鏡觀察　　
結果評判：凋亡細胞體積變小，表面微絨毛消失，細胞質濃縮。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的細胞核內染色質高度盤繞，出現許多稱為氣穴現象（cavitations）的空泡結構，；Ⅱa期細胞核的染色質高度凝聚、邊緣化；細胞凋亡的晚期，細胞核裂解為碎塊，產生凋亡小體。
二、DNA凝膠電泳
（一）瓊脂糖凝膠電泳
凋亡細胞DNA斷裂點均有規律的發生在核小體之間，出現180－200bpDNA片斷，而壞死細胞的DNA斷裂點為無特征的雜亂片斷，利用此特征可以確定群體細胞的死亡，并可與壞死細胞區別。
1、常規的瓊脂糖凝膠電泳
方法一
Western blot 分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及對底物多聚（ADP-核糖）聚合酶[poly（ADP- ribose）polymerase，PARP]等的裂解。
（1）收集細胞（5×106）1000r/min，離心5min，去上清。
（2）PBS洗一次，1000r/min，離心5min，去上清。
（3）加細胞核裂解液500μl重懸細胞，50℃水浴，3～5h，不時振搖或37℃過夜。
（4）加0.5ml平衡酚抽提，上下顛倒幾次混勻，6000r/min，離心5min。
（5）上清移至另一Ep管，加0.5ml氯仿：異戊醇抽提，上下顛倒幾次混勻，6000r/min，離心5min。
（6）上清移至另一Ep管，加50μl的3mol/L乙酸鈉和2ml預冷無水乙醇，上下顛倒幾次混勻，可見絮狀白色沉淀物。

（7）置液氮5～10min，12 000r/min離心10min沉淀DNA，去上清，真空抽干或風扇下吹干殘存液體。
（8）加50～100μl TE緩沖液，另加5μl RNase，37℃水浴30min。
（9）取20μl加上樣緩沖液2～5μl，1％瓊脂糖凝膠電泳（電壓50V，1.5～2h），UV下觀察。
方法二
（1）離心收集細胞（5×106），PBS（無Ca2＋和Mg2＋）洗1～2次。
（2）0.5ml TBE溶液重懸，37℃孵育30min。
（3）1mg/ml蛋白酶K 37℃處理30min。
（4）加入上樣緩沖液0.1ml。
（5）25μl上樣，1.5％的瓊脂糖凝膠上電泳，2V/cm 6h。