細胞骨架系統的顯示與觀察

細胞骨架(cytoskeleton)是指真核細胞胞質中錯綜復雜的纖維狀網絡結構，主要包括微管（microtubule，MT，20~25 nm）和纖絲（filament）兩大類；另外，胞質中還散布著一些3~6 nm的細小纖維。按纖維的直徑、組成成分以及組裝結構的不同，纖絲又可分為微絲（microfilament，MF）、中間絲（intermediate filament，IF）和粗絲（thick filament，TF）三類。微絲是肌動蛋白亞單位組成的螺旋狀纖維（F-actin），直徑為6~7 nm，又名肌動蛋白絲，其長度不定，多分布在近細胞膜的下方。微絲在不同種類的細胞中，它們又與某些結合蛋白一起形成不同的亞細胞結構，如張力纖維（stress fiber）、肌肉細絲、腸上皮絨毛軸心等。現在觀察微絲可以用電鏡、組織化學、免疫細胞化學等手段。本實驗用普通光鏡觀察到細胞骨架，是因為骨架纖維成束分布、結構經染色后，有夸大作用。由于細胞經TritonX-100抽提后剩下的主要是細胞骨架成分，使得顯現更清晰。

細胞骨架在通常情況下不穩定：如低溫、高壓、餓酸處理等。當用適當濃度的TritonX-100處理細胞時，能溶解質膜結構中及細胞內許多蛋白質，而細胞骨架系統的蛋白質卻不被破壞顯得更清晰，M-緩沖液洗滌細胞，可以提高細胞骨架的穩定性，戊二醛固定能較好地保存細胞骨架成分，經考馬斯亮藍R250染色后，可使細胞骨架蛋白著色，而胞質背景著色弱，有利細胞骨架纖維顯示。

1．實 驗 目 的
1．1. 掌握考馬斯亮藍R250（coomassie brilliant blue R250）染細胞胞質微絲的方法。
1．2. 對細胞內微絲的分布有一個整體上的認識。
2．實 驗 原 理

考馬斯亮藍R250是一種普通的蛋白質染料，它可以使各種細胞骨架蛋白質著色，并非特異地顯示微絲，但是由于有些細胞骨架纖維在該實驗條件下不夠穩定，例如微管；還有些類型的纖維太細，在光學顯微鏡下無法分辨，因此我們看到的主要是微絲組成的張力纖維，直徑約 40nm左右。張力纖維形態長而直，常常與細胞的長軸平行并貫穿細胞全長。觀察微絲可以用電鏡、組織化學、免疫細胞化學等手段，本實驗主要介紹用考馬斯亮藍R250顯示由微絲組成的張力纖維的實驗方法。
染色時用的M-緩沖液，其中咪唑是緩沖劑，EGTA和EDTA螯合Ca2+離子，溶液中并提供 Mg2+離子，在此低鈣條件下，骨架纖維保持聚合狀態并且較為舒張。
3．實 驗 用 品

3．1 材料 洋蔥鱗莖內表皮細胞或培養的成纖維細胞。
3．2 試劑
3．2．1. 0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖生物鹽水(PBS)配法
0.2mol/L Na2HPO4/KH2PO4緩沖液(pH7.3) 50 ml
NaCl 0.15 mol/L
重蒸餾水 至1000 ml
其中PB的配法: 0.2mo1/L Na2HPO4 77 ml
0.2mo1/L NaH2PO4 23 ml
3．2．2. M-緩沖液
咪唑(imidazole, pH6.7) 50 mmol/L
KC1 50 mmol/L
MgCl2 0.5 mmol/L
EGTA l mmol/L
EDTA 0.l mmol/L
巰基乙醇(mercaptoethanol) l mmol/L
甘油 4 mmol/L
用1 mol/L HCl調pH至7.2。
3．2．3. 1%的Triton X-l00/M-緩沖液
3．2．4. 0.2%考馬斯亮藍R250染液，溶劑是:
甲醇 46.5 ml
冰醋酸 7 ml
蒸餾水 46.5 ml
3．2．5. 30%戊二醛-PB溶液，pH7.2
3．3 器材 普通光學顯微鏡、恒溫箱、培養皿、燒杯、吸管、載玻片及蓋玻片、鑷子。
4．實 驗 方 法
撕取一薄片洋蔥鱗莖內表皮細胞（約1cm3）于載玻片上或取長有成纖維細胞的蓋片條
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PBS液輕輕涮洗
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l% TritonX-l00/M-緩沖液處理l5min（室溫或37℃）
（Triton X-l00是非離子型表面活性劑(去污劑)，能增加細胞膜通透性并抽提部分雜蛋白質，使骨架圖像更清晰）
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M-緩沖液輕輕洗細胞3次（穩定細胞骨架）
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3%戊二醛-PB液固定細胞5~l5min
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PBS液洗細胞若干次
↓濾紙吸干
0.2% 考馬斯亮藍R250染片30min
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小心地用水漂洗
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空氣干燥
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直接觀察或用樹脂封片