細菌產生滅活的抗菌藥物酶使抗菌藥物失活是耐藥性產生的最重要機制之一，使抗菌藥物作用于細菌之前即被酶破壞而失去抗菌作用。這些滅活酶可由質粒和染色體基因表達。β-內酰胺酶：由染色體或質粒介導。對β-內酰胺類抗生素耐藥，使β-內酰胺環裂解而使該抗生素喪失抗菌作用。β-內酰胺酶的類型隨著新抗生素在臨床的應用迅速增長，詳細機制見β-內酰胺類抗生素章。氨基苷類抗生素鈍化酶：細菌在接觸到氨基苷類抗生素后產生鈍化酶使后者失去抗菌作用，常見的氨基苷類鈍化酶有乙酰化酶、腺苷化酶和磷酸化酶，這些酶的基因經質粒介導合成，可以將乙酰基、腺苷酰基和磷酰基連接到氨基苷類的氨基或羥基上，使氨基甘類的結構改變而失去抗菌活性；其他酶類：細菌可產生氯霉素乙酰轉移酶滅活氯霉素；產生酯酶滅活大環內酯類抗生素；金黃色葡糖球菌產生核苷轉移酶滅活林可霉素。