編輯效率通過增強型PE系統提高

　　最先進的prime editor 3 (PE3)系統包括編輯器、Cas9 H840A缺口酶和突變體逆轉錄酶（RT酶）的融合蛋白（以下簡稱NMRT）、prime editing guide RNA (pegRNA)和另一種單向導RNA（sgRNA）。pegRNA包含一個引物結合位點（PBS）和一個逆轉錄（RT）模板，用于引入新的遺傳信息。

　　2021年6月8日，西北農林科技大學王小龍及上海科技大學黃行許共同通訊在Cell Research上在線發表了題為“Enhancing prime editing by Csy4-mediated processing of pegRNA”的文章，發現PBS一般在pegRNA的3′端有10-16 nt，與pegRNA的5′端部分間隔物互補，它們的退火預計會導致pegRNA環化，這可能會妨礙編輯。

　　總之，該研究在PE中引入了多種修飾以產生ePE，這明顯地提高了編輯效率。然而，ePE可能會引起indels，而且在該系統中加入Csy4可能會妨礙其傳遞。因此，還需要進一步優化。

　　為了驗證這一假設，研究人員通過刪除PBS和RT（"截斷的pegRNA"）或用與PBS相同大小的隨機序列代替PBS來制作不可環化的經典pegRNA衍生物，然后比較它們與經典pegRNA一起在四個目標基因（FBN1、ALDOB、SITE1和FTL）上誘導Cas9介導的DNA indels的能力。

　　事實上，這兩種變化可以防止pegRNA的潛在環化，經典pegRNA、截短pegRNA和RaPBS-pegRNA誘導縮減的效率為14.2%、53.2%和36.0%（在FBN1）或55.4%、75.5%和81.4%（在ALDOB）或6.0%、55.8%和42.5%（在SITE1）或14.7%、25.6%和24.2%（在FTL）。

　　接下來試圖防止pegRNA環化，同時保持PBS和RT模板的完整性，這對pegRNA在PE系統中的功能至關重要。為此，將20nt的Csy4識別位點融合到經典pegRNA的3′端。這個位點自然存在于I-F型CRISPR-Cas系統中，形成一個發夾，當附加到pegRNA上時可能會抑制環化。在FBN1的效率從14.2%提高到23.8%，在ALDOB的效率從55.4%提高到74.9%，在SITE1的效率從6.0%提高到32.2%，在FTL的效率從14.7%提高到23.8%。

　　使用PE3，接下來比較了經典pegRNA（經典PE）和擴展pegRNA（擴展pegRNA PE）在產生點突變方面的性能，發現在測試的6個位點上，不同編輯類型的靶向堿基轉換率明顯提高。隨后，將nick-sgRNA與擴展的pegRNA相融合，使它們在一個轉錄本中共同表達，這可能有助于優化這兩種引導物的化學計量。同時，為了將nick-sgRNA從轉錄本中釋放出來，將NMRT與Csy4-T2A相融合，Csy4 RNase可以選擇性地在Csy4識別位點的3′端進行切割。用pCMV-Csy4-NMRT，表達含有擴展pegRNA和nick-sgRNA的單一轉錄本（該PE被命名為共表達PE）與經典PE相比，在6個測試位點的點突變平均增加0.8倍。

　　將pegRNA支架中連續的第四個尿嘧啶突變為胞嘧啶，消除了一個假定的轉錄終止信號，從而增加了pegRNA的表達和質粒編輯。因此，將擴展的pegRNA支架上的連續尿嘧啶的第四個尿嘧啶突變為胞嘧啶。由此產生的PE系統被稱為增強型質粒編輯系統（ePE）。

　　ePE顯示，在HEK293T細胞中，6個測試位點的點突變平均增加了1.0倍，在其他位點增加了2.6倍。因此，與傳統的PE相比，ePE導致點突變的編輯效率平均提高了1.9倍。同樣，在HeLa細胞中，EPE的活性比經典PE高3.8倍，在小鼠N2a細胞中高4.9倍。

　　基因組編輯的保真度對其治療和臨床應用具有重要意義。三條證據表明，ePE的保真度與典型的PE相當。首先，在所有13個測試的人類位點上，圍繞目標堿基2bp的編輯副產品對于EPE來說是檢測不到的，就像經典的PE一樣。第二，在突變時，EPE在目標位點上誘導出的非預期的indels的頻率僅略高于傳統的PE。第三，在縮減過程中，EPE誘發了類似水平的非預期indels。最后，檢查了Cas9缺口酶在Cas-OFFinder5預測的位點上進行的脫靶編輯，發現這兩個系統是相當的。

　　總之，研究人員在PE中引入了多種修飾以產生ePE，這明顯地提高了編輯效率。然而，ePE可能會引起indels，而且在該系統中加入Csy4可能會妨礙其傳遞。因此，還需要進一步優化。