熒光PCR的分析方法

對熒光定量PCR結果的分析方法我們分為兩種：絕對定量分析法和相對定量分析法。

1、絕對定量分析方法，起始濃度的對數跟循環數的線性關系，標準曲線由已知拷貝數的標準品繪制，根據樣品的Ct值，可求樣品的模板量。

（1）標準品的制備：

1V的樣品原液（i）+9V稀釋緩沖液，得到ii；

1Ｖ的ii +9V稀釋緩沖液，得到iii；

1V的iii + 9V稀釋緩沖液，得到iv；

1V的iv +9V稀釋緩沖液，得到v。

（2）拷貝數的計算：待測樣本濃度（ng/ul）=OD260×40*稀釋倍數

樣品分子量+堿基數×324

待測樣本拷貝數=待測樣本濃度/樣本分子量×6×10¹⁴

從擴增數據得到循環數，通過標準曲線，我們可以求出樣品的拷貝數。

2.相對定量分析方法：

其又可有雙標準曲線法和雙Ct法。所謂相對，就只是實驗前后結果的對比，反映了反應前后的數據的差值。

（1）雙標準曲線法，分析簡單，但是對于每一個基因，每一輪實驗都需要做標準曲線，而且必須有特定的標準品作標準曲線，這樣的標準品不代表樣品擴增的真實狀態。這種方法常用于基因表達調控。

Ｆ＝待測樣品目的基因濃度/待測樣品參照基因濃度÷對照樣品目的基因濃度/對照樣品參照基因濃度

（2）雙Ct法，此方法不用對看家基因和目的基因做標準曲線，而只需要對待測樣品分別進行ＰＣＲ擴增即可，標準曲線的差值＜０．１．假若擴增效率為１００％或標準曲線及每次擴增之間的效率都保持一致，這樣實驗條件優化較難為復雜。這種分析方法較長用于基因表達調控研究中。