熒光PCR法檢測RNasin性能效果

實驗目的：對RNasin性能效果進行檢測及評估。

實驗材料及設備：

模板RNA：大鼠肌肉組織RNA
引物：Rat β-acting：Forward CCCATCTATGAGGGTTACGC
Reverse  TTTAATGTCACGCACGATTTC
RNase：50mg/ml（simgen）
RNasin：40U/μl
cDNA第一鏈合成試劑盒（simgen）、2×SYBR Green PCR mix（simgen）
設備：ABI 7000 熒光PCR儀、普通PCR儀、離心機及移液器
其他耗材：0.6ml離心管，八連排管，RNase-free吸頭，一次性手套及防護用品和紙巾。

實驗方法：利用逆轉錄反應將RNA逆轉錄成cDNA及SYBR Green熒光PCR方法對RNasin產品的性能效果進行檢測評估。

實驗方案：

設計思路：

1. 編號1-4為測試同一批RNasin的性能，1號與3號是測試相同RNA量和RNase量，加不加RNasin對cDNA合成的影響，即RNasin抑制RNase的活性效果。

2. 4號是表示在不添加RNase和RNasin時的空白對照。

3. 2號與3號是測試在相同RNA量和RNasin量的條件下，改變RNase的量，RNasin對不同量的RNase的抑制效果有什么變化。

實驗步驟：

1.將模板RNA在冰上解凍；5×gDNA Buffer、RNasin、RNA(500ng/ul)、RNase、RNA-Free H2O、5×RT Buffer、RT-Enzyme mix、RT-Primer mix 、2×SYBR Green PCR Mix、引物、在室溫（15-25℃）解凍，解凍后迅速置于冰上。使用前將每種溶液渦旋振蕩混勻，簡短離心以收集殘留在管壁的液體。

注：RNase稀釋需在抽風口或遠離PCR操作室的實驗室。

2. 按照表1的基因組DNA的去除體系配制混合液，徹底混勻。簡短離心，并置于42℃，孵育30min，以保證RNase有充分時間去降解RNA。然后置于冰上放置。

表1  gDNA去除反應體系

注：

1.  RNA的濃度是500ng/μl,RNA的濃度不能太低，且RNA需在RNase之前添加，否則可能被RNase降解完從而在熒光PCR上反映不出差異。

2.   RNase的濃度分別為1ng/μl和10ng/μl，故在加入RNase時均加入2μl，保證不同的量相同體積，以減少誤差，在加RNase的時候應盡量在無RNase的環境中添加，以免環境中RNase過多而導致RNA降解嚴重從而在熒光PCR上反映不出差異。

3.  RNasin的濃度為40U/μl，添加RNasin應在加RNA之前添加。

后續cDNA合成步驟參考cDNA第一鏈合成試劑盒（simgen）說明書操作。所得cDNA稀釋5倍，置于冰上備用。

熒光PCR步驟參考2×SYBR Green PCR Mix（simgen）說明書操作。
將稀釋好的cDNA模板按照5μl/管加入到熒光PCR反應體系混合液中，進行熒光PCR擴增，觀察實驗結果。

實驗結果：

在加2ng RNase時，加不加RNasin對cDNA的合成是有明顯影響的，即3號比1號的CT值要小6個CT，表示它們的起始cDNA濃度相差大概26倍,說明RNasin對RNase的影響是非常大的。

從2號與3號對比，說明在相同量的RNasin下，當RNase的量增加到20ng時，80U RNasin的效果還不足將RNase完全抑制，說明一定量的RNasin只能對一定量的RNase有足夠的抑制作用。