蛋白酶的測定實驗——酪蛋白測定法

實驗中的氨基酸由蛋白酶從酪蛋白中水解下來。在分離出 TCA 沉淀中未分解的蛋白質后，用分光光度測定的方法對其上清液分析，氨基酸來自于酪蛋白。依據酪蛋白校準曲線，已對其量化。這個鑒定不是很敏感。

酶樣品

Tris-HClNaOH乙酸三氯乙酸L-酪氨酸酪蛋白底物

分光光度計

實驗所需「試劑」具體見「其他」

0.4 ml 酪蛋白底物被恢復到 35℃，并加入 0.2 ml 蛋白酶溶液（含 0.01 mol/L Tris-HCl，pH 8.0，10 mmol/L CaCl₂）。混合物在 35℃ 孵育 10 min，加入 1 ml 1.2 mol/L 的 TCA 停止反應。用同樣方法處理空白對照，不同的是在加入 TCA 之后向酪蛋白底物中加蛋白酶溶液。樣品離心 5 min，并取上清液測量其在 275nm 處的吸收值。

一個單位被定義為：35℃ 時，1 min 后，產生相當于校準曲線中 1 umol 的酪氨酸所產生的吸收值的蛋白酶量。校準曲線是用不同濃度的酪氨酸溶液繪制的。

試劑：

0.01 mol/L Tris-HCl，pH8.0，包含 10 mmol/L CaCl₂

0.2 mol/L NaOH（Mr＝40.0；0.8 g 溶于 100 ml 水中）

0.2 mol/L 乙酸（Mr＝60.05；12 g 加到 1 L）

1.2 mol/L 三氯乙酸（TCA，Mr＝163.4；19.6 g 溶于 100 ml 水中）

1 mmol/L L-酪氨酸（Mr＝181；18.1 mg 溶于 100 ml 0.2 mol/L HCl）

酪蛋白底物：2 g 酪蛋白溶于 90 ml 0.01 mol/L Tris-HCl pH 8.0、10 mmol/L CaCl₂ 和 0.2 mol/L NaOH，而后用 0.2 mol/L 的乙酸調 pH 至 8.0，并用 H₂O 將溶液補充至 100 ml。溶液被分為等分試樣并儲存于 -20℃。