血液病骨髓細胞DNA變異臨床意義

  為探討病患兒DNA的變異，我們采用流式細胞儀（FCM）檢測54例血液病患兒骨髓單個核細胞（MNLL）的DNA含量，以分析其倍體水平及細胞增殖周期，進一步探討其臨床意義。

　　1、對象與方法

　　1.1對象 （1）急性白血病組（AL）:初診為AL42例，其中急性淋巴細胞性白血病（ALL）22例，急性非淋巴細胞性白血病（ANLL）20例。（2）初診為非白血病的常見血液病組12例:4例急性特發性血小板減少性紫癜（AITP），慢性特發性血小板減少性紫癜（CITP）、再生障礙性貧血（AA）、急性溶血性貧血各2例，營養性缺鐵性貧血、粒細胞減少癥各1例，均經臨床及檢查確診，年齡2～14歲，平均年齡6.5歲。（3）正常對照組15例，為骨髓象正常的兒童，年齡2～14年。平均年齡6.7歲。

　　1.2方法 （1）樣品制備:取肝素抗凝骨髓0.1ml，按常規方法分離MNC，每個測定管加骨髓細胞10 6個，然后依次加入DNA測定液（Coulter DNA Kit），室溫保存30min，然后加入PI染色液（終濃度為100μl/ml）。室溫下30min后上機測定。（2）DNA測定方法:流式細胞儀FACscan（Coulter公司），15mW氬離子激光光源，發射波長488nm，每個樣品測定10000個細胞，采用Coulter公司提供的DNA分析程序，獲取 各樣本細胞周期時相百分比。流式細胞檢測方法:采用Coulter公司生產的流式細胞儀FACscan進行參數檢測，每個樣本隨機測定10 4個細胞，并求出細胞生長分數（%）=（S+G 2 /M）/（G 1 +S+G 2 /M）×100%，將測量的數據、圖形同步輸入HP-300Consort30計算機，應用相應軟件程序進行資料處理。（3）倍體分析:根據DNA指數（DI）判斷，本DI正常范圍是0.90～1.10，小于0.9為亞二倍體，大于1.10為超二倍體。

　　1.3統計學處理采用t檢驗和X 2檢驗。

　　2、結果

　　2.1 DNA異倍體檢出率白血病組異倍體檢出率57.1%（24/42），其中ALL68.2%（15/22），ANLL為25%（5/20），兩者比較存在顯著差異（P<0.05），血液病組異倍體檢出率33.3%（4/12），與白血病組比較存在顯著差異（P<0.05）。正常對照組無1人檢出異倍體。

　　2.2細胞周期分布見表1。ALL及ANLL組G 0 /G 1 %均明顯高于對照組（P<0.01），S%+G 2 /M%則明顯低于對照組（P<0.05）。ALL組與ANLL組比較，各周期細胞分布無顯著差異。血液病組DNA分析圖形除了有4例異倍體外，其余均與正常對照組相似，細胞周期分布各值與正常對照組比較無顯著差異。1各組的骨髓細胞周期分布 注:與對照組比較ˇP<0.05

　　3、討論

　　近年來，FCM廣泛應用于腫瘤細胞學的臨床診斷，人體正常的細胞具有較恒定的DNA二倍體含量，當人體癌變及具有惡性潛能的癌前病變時，在其發生、發展過程中可伴隨細胞DNA含量的異常改變［1］ 。本文結果表明，白血病異倍體檢出率為57.1%（24/42），血液病患兒異倍體檢出率為33.3%（4/12），兩組存在顯著差異。經追蹤，4例異倍體初診為非白血病中，1例CITP轉變為骨髓增生異常綜合征（MDS），1例AA發病為ANLL。因此，初診為血液病的患兒，臨床進行骨髓細胞形態學檢查的同時，應用FCM檢測其骨髓MNC的DNA含量，對DNA含量異常的非白血病患兒，應高度注意其癌變的可能。

　　本資料顯示，白血病異倍體檢出率顯著高于非白血病組，因此DNA倍體改變在AL中極其常見，而且ALL的DNA異倍體檢出率明顯高于ANLL組，從遺傳學角度分析AL的發病機制表明ANLL患兒的染色體異常較多地表現為結構異常，而不是數目的異常，還可能是臨床上ANLL較ALL緩解率低的原因之一。此外，本文接受治療的8例ALL中6例達到完全緩解（CR），其中4例為超二倍體，另2例分別為二倍體和亞二倍體，提示超二倍體患兒的CR率高，預后較好，與多數文獻報道一致 ［2，3］ 。
細胞周期中S期比例代表該細胞群體中增殖細胞的數量，從側面反映細胞的增殖狀態，本文AL組骨髓細胞的G 0 /G%明顯高于正常對照組，而S%及S+G 2 /M%明顯低于對照組，說明了白血病骨髓細胞從G 0 /G 1期至S期之間存在運行阻滯，表明白血病骨髓細胞的增殖能力低于正常。追蹤結果發現同一患者在不同病期的白血病細胞增殖狀況不同，3例ALL達到CR后，其S%（分別為30.2%，28.5%，26.3%）和S+G 2 /M%（分別為35.3%，30.2%，33.5%）均明顯高于初診時的S%（分別為10.5%，12.4%，13.1%）和S+G 2 /M%（分別為9.5%，13.8%，20.6%），說明AL患兒CR后各期比例恢復正常，骨髓造血功能恢復，我們將繼續應用FCM定期測定AL患兒骨髓細胞周期分布，了解細胞增殖狀態，施以相應的治療，提高治療AL的療效。