血細胞分離技術

實驗概要

血細胞是免疫學研究或臨床檢驗常用的檢測對象或試驗材料，分離和純化血細胞是實驗室中的基本技術。目前分離血細胞的技術大多是根據各種細胞群特有的大小、沉降率、粘附性和吞噬能力等設計而成。

實驗原理

外周血液中的紅細胞與白細胞的比例在幾百甚至上千比一，兩類細胞的大小和密度不同，其沉降速度也就不同，紅細胞自然沉降率較快，加入高分子量的聚合物如明膠或右旋糖酐，還可加速其凝聚。另外，用低滲溶液處理紅細胞可使之溶解。因而常用自然沉降法和密度梯度離心法分離被檢血液中的淋巴細胞。

主要試劑

1. 抗凝劑1000u/ml肝素溶液(先稱取每mg含100u的肝素100mg，溶于10ml 0.9%滅菌生理鹽水中)，或3.8%乙二胺四乙酸(EDTA)溶液。

2. Hank′s液

3. 淋巴細胞分層液所用的分層液為聚蔗糖(Ficoll)泛影葡胺(Urografin)混合液，比重為1.077~1.078；或泛影葡胺與右旋醣酐(Dextran)配成比重為1.07~1.09供用。

   9%聚蔗糖24份

   3.4%泛影葡胺10份

以上二液混合后，用G5玻璃過濾器濾過除菌，4℃冰箱保存備用。

   3.4%泛影葡胺10份

   6.0%右旋醣酐125份

以上二液混合后，分裝于棕色瓶內，4℃冰箱保存備用。

4. 3%明膠液配制稱取明膠30g，溶于0.9%滅菌生理鹽水100ml中，114.3℃高壓蒸汽10min滅菌，冷卻后，4℃冰箱保存，臨用時于37℃水浴預熱10min。

5. 紅細胞保存液(阿氏液，Alsever氏液)枸櫞酸鈉Na₃C₆H₅O_7.5H₂O 0.8g，葡萄糖2.05g，枸櫞酸0.0325g，氯化鈉0.42g，蒸餾水加至100ml。114.3℃高壓蒸汽滅菌10min。

實驗步驟

1. 血液標本的采集

測定血細胞免疫功能的試驗以采靜脈血為宜。采集血液最關鍵的是抗凝，選擇什么樣的抗凝方法，要根據實驗的要求和條件而定。常用的抗凝方法有3種，操作方法如下：

    1) 機械去除纖維蛋白法：預先將適量的小玻璃珠(根據采血量多少而定)清洗后，裝入采血容器中，滅菌后用于采血。采血過程中，邊采血邊輕搖采血瓶，以使小玻璃珠在血液中分散，去除纖維蛋白，使血液不能凝固。本法雖較麻煩，但不需要特殊的試劑，又不影響血細胞活性，且可減少血小板混雜。

   2) 肝素抗凝法：肝素是含硫酸基的粘多糖，常用其鈉鹽或鉀鹽，它能阻止凝血酶原轉化為凝血酶，進而抑制纖維蛋白原形成纖維蛋白而防止血液凝固。常用的肝素溶液濃度為1000u/ml，4℃保存備用。采血前按每ml血液0.1~0.2mg或10~20u肝素加入采血容器，輕輕轉動，使肝素溶液均勻潤濕采血容器壁，然后進行采血，采血時要輕而緩慢地不斷搖動采血容器。

   3) 乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝法：作為螯合劑的EDTA可與血液中鈣離子結合而抗凝。常用其鈉鹽，一般先用生理鹽水配制成4%的溶液，采血前按每ml血液1~2mg加入采血容器，然后進行采血，并不斷緩慢搖動采血容器。

2. 淋巴細胞的分離及采集

   1) 自然沉降法：取肝素抗凝血20ml，加3%優質明膠10ml，于37℃水浴中靜置30~45min，使細胞下降，然后吸取上層血漿和白細胞的混合物，以2 000r/min離心沉淀10min。棄上層血漿，管底細胞用Hanks液洗滌兩次后，用細胞營養液4ml配成淋巴細胞懸液，淋巴細胞數約為5×10⁶個/ml。

   2) 密度梯度離心法：

      a. 將抗凝血20ml加等量Hanks液混合，沿管壁用毛細管慢慢加到20ml分層液于抗凝血表面后(切不可顛倒混合)，置水平離心機，以2 000r/min離心20min，可出現分層；

      b. 用毛細管仔細將血漿和分層液之間較薄、但比較清楚的乳白色淋巴細胞層吸至含5ml Hanks液的試管中，混勻后，以1 000r/min離心10min，棄上清后，再用Hanks液洗一次；

      c. 盡量吸去上清液，將沉于管底的淋巴細胞小塊搖散，做細胞計數，用Hanks液配成5×10⁶個/ml的淋巴細胞懸液。

3. 紅細胞的分離及采集無菌采取血液，加入阿氏液中,以2 000r/min離心10min，連續離心洗滌三次后，取壓積紅細胞，配成所需的紅細胞懸液即可。