視網膜母細胞瘤的診斷應該在新生兒出生3個月內就進行，診斷內容主要包括：
紅色反射檢查：該項檢查應在暗室中進行，用光線照射眼睛后應見橘紅色眼底，即為正常視網膜顏色。
角膜光線反射：該項檢查通過對角膜進行光線的照射，觀察反射亮點的位置來確定新生兒是否患有斜視。
眼部檢查：檢查眼睛是否有任何結構異常。
以下疾病與視網膜母細胞瘤存在一定的相似癥狀，診斷時應該進行鑒別：
永存原始玻璃體增生癥（PHPV）：該病是由于先天性的眼部發育不正常，胚胎初期的原始玻璃體沒有消退導致的，眼部會產生“白瞳”現象，同時還會存在小眼球等結構，通常只發生于單眼。該病會發展成為白內障。
外層滲出性視網膜病變：該病又稱Coats 病，通常只發生于單眼，由于視網膜后部的血管不正常的生長導致視網膜血管畸形并影響視力、白瞳或斜視等癥狀。
眼弓首線蟲病：該病是由于犬蛔蟲侵入人體眼部導致的，會導致患者視力下降，出現白瞳和斜視等癥狀。
早產兒視網膜病變（ROP）：該病是由于早產兒在出生后立刻吸入氧氣所致，會導致視網膜組織受損并引發視網膜脫落等癥狀。
核磁共振成像所示的視網膜母細胞瘤（包含視神經部分）
如果眼部檢查已顯示出存在異常，那么接下來的檢查可能還包括各種圖像診斷，例如CT掃描、核磁共振成像以及超聲波掃描等。CT掃描與核磁共振成像可以幫助確定結構異常以及鈣的分布，而超聲波檢查則可以檢查出腫瘤的大小與厚度。通過骨髓檢查或者腰椎穿刺可以檢查腫瘤是否發生了轉移。