角蛋白不溶于水及大部分有機溶劑，使得角蛋白酶活性測定比一般蛋白酶困難。常用測定角蛋白酶的原理是以底物水解后釋放的氨基酸的量來確定角蛋白酶的活性。目前測定角蛋白酶的方法主要有三種，一種是直接用角蛋白粉作為底物進行測定，涂國全等（1998）曾以羽毛粉作為測定角蛋白酶的底物[59]。第二種是使用經過修飾的底物進行酶活測定，該方法中作為底物使用的角蛋白被連接上生色基團，通過測定底物水解后放出的生色物質的含量可以判斷酶的活性。具有代表性的兩種底物是偶氮角蛋白[62]和天青角蛋白[63]，前者將偶氮連接于羽毛角蛋白上的自由氨基酸殘基，后者為羊毛角蛋白與三甲基硫堇結合的產物。第三種則是以可溶性的羽毛角蛋白作為底物表征角蛋白酶的活性，該方法由Wawrzkiewicz提出并被廣泛采用。它是利用二甲基亞砜溶解羽毛角蛋白，再用異丙醇經行沉淀，干燥后的可溶性角蛋白溶解于相應的緩沖液中作為底物。