estern Blot（WB）可以說是生物學方向的同學最...最基本的實驗技能了，然而好看的 WB 總是別人的，自己的 WB 總是雜帶叢生，尤其是新課題、新抗體，總在目的條帶附近出現非特異性條帶。產生這種狀況的原因是什么呢、用下面的幾個例子，咱們一起研究一下。
案例一：啥也沒有
原因：比較多，如果單純一張沒有任何顯色的X光片，最可能是一抗加成其他抗體，或者二抗種屬加錯了，比如兔的加成鼠的。
解決辦法：仔細檢查抗體是否加錯，確認轉膜沒有問題。
經驗：上面的圖片展示的是一點信號都沒有，如果是這樣大部分情況是抗體加錯了。如果中間出現了細微的條帶，可能原因是蛋白上樣量太少，一抗濃度過低，ECL發光液失效。另外如果轉膜出現了問題，比如膜放反了，自然是一個白片。
案例二：高背景
原因：封閉不夠好，一抗濃度高，洗膜時間和次數不夠
解決辦法：降低一抗濃度，增加洗膜時間和次數。
經驗：高背景可能是WB中最常見出現的問題，目的條帶單一清晰，但是其他地方又彌漫性較為均一的背景（比較連續的）。其實只要我們注意操作規范，不偷工減料就很容易避免，洗膜按照規定來5min*5次或者10min*3次，不要改成5min*3次，或者10min*2次。
案例三：非特異性條帶
原因：一抗非特異性與蛋白結合
解決辦法：更換一抗
經驗：此種情況絕大多數是因為一抗不好，你無法判斷那一條是目的條帶。如果實在沒有更好的抗體，建議采用陰性對照和陽性對照來確定上述哪個條帶是目的條帶。當然這種情況下有一種很小幾率的可能是一抗濃度太高引起的非特異性結合。
案例四：條帶中出現邊緣規則的白圈
原因：電轉中膜和膠之間存在氣泡。
解決辦法：轉膜前去掉膜和膠之間的氣泡
經驗：我們常常將電轉液倒入一個盤子里，倒入的液體不能太多也不能太少，最好的高度是與放上第一層濾紙齊平，然后往濾紙上澆點轉膜液，把電泳膠用清水清洗下，將電泳膠平鋪到濾紙上，仔細檢查濾紙與膠之間是否有氣泡，可以左右前后觀察，不同方向觀察之后確認無氣泡。
然后再往膠上面澆點電轉液，用兩只手的拇指和食指輕輕夾住PVDF膜的兩側中間，使膜成U型，然后將U型的底部接觸膠的中間，慢慢往兩邊放下膜，這樣一般氣泡很少。然后上層濾紙同樣用U型的放置方法，用玻璃棒稍微貼實下，然后蓋上海綿。注意不要來回趕氣泡，這樣反而會帶入氣泡。
案例五：條帶中間出現白色（反白）
原因：中心部位高濃度HRP把底物消耗過快，中間部位底物消耗結束之后就不發光了
解決辦法：降低蛋白量，降低一抗和二抗的濃度。
經驗：如果你足夠迅速，可以在中間部位底物消耗之前就把X光片給定影出來，但是時間很難把握，建議還是從降低蛋白量，降低一抗二抗濃度入手。
其他問題
（1）蛋白分子量偏高或者偏低。可能是膠的濃度與目的蛋白的濃度不對應，比如說100KD的蛋白你用12%的膠跑，或者說20KD的蛋白你用6%的膠跑。
（2）蛋白質降解。蛋白質降解后很可能會在比原來位置低的地方出現主帶，然后會出現一些其他帶，最主要特點是所有的條帶比正常的都低，并且條帶模糊不清晰。
（3）所有條帶連成一片沒有間隔。原因最可能是上樣量過多，其次是樣品彌散（比如電泳長時間停止樣品彌散）。
產生上述現象的時候，不妨先思考幾個問題：
你的樣品類型是組織還是細胞？
如果是組織，提取物會傾向于有較高的背景和降解條帶。
如果是細胞，傳代是在 15 代以內還是 15 代以上？
細胞系是否新鮮，有沒有加蛋白酶/磷酸酶抑制劑和超聲處理？
思考完這些問題，我們一起再從九個方面詳細分析一下，哪些因素會導致你的結果出現多條非特異性條帶：
-1-
原因：細胞系傳代次數過多，蛋白表達譜發生變化。
建議：使用未傳代或傳代次數較少的細胞系（不超過 15 代）進行樣品制備。
-2-
原因：與細胞系裂解物相比，原代細胞或組織提取物會傾向于有較高的背景和降解條帶。
建議：用新鮮提取的，經過超聲處理的澄清的組織提取物能降低背景；
同時，用去垢劑含量較高的 RIPA buffer 裂解組織，可得到裂解更徹底、一致性更高的裂解物。
-3-
原因：蛋白被降解。
建議：
提取液確保含有蛋白酶抑制劑，并超聲；
蛋白樣品提取后分裝－20 ℃ 或－80 ℃ 短期保存，避免反復凍融，有條件盡量用新鮮提取的蛋白。
-4-
原因：蛋白本身有很多修飾。
建議：查閱文獻，確定目的蛋白是否存在多種修飾，泛素化、糖基化等修飾會讓蛋白的條帶發生較大的偏移。
-5-
原因：所檢測蛋白存在多種剪接體，導致分子量大小不同。
建議：查閱文獻或者通過搜索數據庫來確定該蛋白是否存在多種長度不同的編碼 mRNA。
-6-
原因：蛋白存在二聚體或多聚體。
建議：SDS loading buffer 中現用現加 β－巰基乙醇或 DTT。
-7-
原因：樣本存在外源轉入蛋白。
建議：檢查所用樣本是否有過被外源進去帶有標簽的靶標蛋白。如有，更換細胞系樣本。
-8-
原因：上樣量過多。
建議：根據靶標表達情況，梯度上樣跑膠后選擇合適的上樣量，通常 20~50 μg 即可。
-9-
原因：實驗操作與 CST 推薦的步驟有較大出入。
建議：
CST 推薦封閉液用 5% 脫脂奶粉／TBST，室溫 1 h；
一抗稀釋液、稀釋比參考抗體說明書，推薦 4 ℃ 過夜孵育；
二抗用 5% 脫脂奶粉／TBST 稀釋，工作濃度切忌過高，室溫孵育 1 h；
要用 1XTBST 緩沖液充分洗滌。