酵母轉化實驗_原生質體轉化

酵母

YPD山梨醇CaCl2-MEPEG選擇性再生瓊脂

水浴鍋離心機分光光度計培養箱

1.  在實驗前2天，將轉化用酵母菌株的單菌落接種到5 ml YPD培養基中，于30℃培養過夜（如果酵母菌株是溫度敏感的應在低溫下培養）。

2.  轉化前一天晚上，從5 ml 過夜培養液中取適量的菌液，接種于盛有50 ml YPD培養基的250 ml 無菌燒瓶中，再過夜培養，使細胞密度達到1~2×10⁷細胞/ml（OD₆₀₀=0.5~1.0，依據菌株的不同有一定的差別）。

3.  室溫下，1 100 g 離心5 min 沉淀細胞，細胞用10 ml 1mol/l 山梨醇溶液重懸，重復離心一次，細胞沉淀用5 ml 1 mol/l 山梨醇重懸。取適量的懸液用無菌超純水作10^-6稀釋后取其中的0.1 ml 涂YPD平板，于30℃培養2天。

4.  將細胞懸液轉移到50 ml 的燒瓶中，分別加入5 μl 2-巰基乙醇和150 μl Glusulase。于30℃緩緩地搖動溫育約30~60 min，取適量無菌超純水作10^-3稀釋后，從中取0.1 ml 涂布在YPD平板上，于30℃培養2天，

5.  將原生質體移到一個50 ml 圓底離心管中，室溫下400 g 離心4 min。

6.  輕輕倒去上清，不要攪動細胞沉淀。加2 ml 1 mol/l 山梨醇，輕輕搖動液體重懸沉淀（沉淀細胞應該很容易離開管壁）。

7.  加入8 ml 1 mol/l 山梨醇溶液，以400 g 離心沉淀細胞，步驟6和7重復1次。

8.  重復步驟6，加入7 ml 1 mol/l 山梨醇和1 ml CaCl₂溶液，輕輕混勻，400 g 離心4 min，細胞以1 ml 山梨醇/CaCl₂溶液重懸。

9.  往150~200 μl 細胞懸液中加入待轉化的DNA（最多可達10 μg）和10 μl 擔體DNA，室溫下溫育10 min。

10.  加10體積的PEG/CaCl₂溶液，混勻，室溫下靜置10 min。

11.  以400 g 離心4 min 沉淀細胞。輕輕倒出含PEG的上清，細胞用0.5 ml 山梨醇/CaCl₂溶液輕輕重懸，將懸液移至10 ml 已融化并保溫于55℃水浴的再生瓊脂中，在旋渦混合器上短促混勻，然后迅速倒在適當的CM省卻成分培養基平板表面，轉動平板進一步混合細胞和瓊脂。

12.  于30℃（或其他適當的溫度下）培養直到菌落出現，菌落會出現在再生瓊脂的表面或瓊脂中，挑單菌落，在同樣的選擇平板上劃線。如果轉化的目的是為了破壞基因組序列，那么應從幾個轉化體制備DNA，以便通過DNA雜交分析相關染色體的區域。

1.  千萬不要用漩渦混合器振蕩或劇烈搖動原生質體。如果這些細胞沉淀不易重懸，應盡管縮短離心的時間和轉速。

2.  加入DNA的體積不應超過細胞懸液體積的1/10，每一次轉化應該轉化一個只加擔體DNA的對照，即可指示回復突變的頻率。