測定小麥中T-2毒素的酶聯免疫吸附法有間接競爭性酶聯免疫吸附測定法和直接競爭性酶聯免疫吸附測定法。
(1)間接法
①試劑
a.化學試劑:T-2毒素,四甲基聯苯胺,甲醇,石油醚,三氯甲烷,無水乙醇,乙酸乙酯,二甲基甲酰胺,吐溫-20,30%過氧化氫等。
b.緩沖溶液
包被緩沖液:50mmol/L 碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液,PH9.6。
洗液:含0.05%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液,PH7.4。
樣品與T-2毒素標準溶液稀釋液,含20%甲醇的溶液。
底物緩沖液:0.1mol/L的磷酸-檸檬酸緩沖液,PH5.0。
底物溶液:取50μL 四甲基聯苯胺溶液加10mL 底物緩沖液、10μL 30%過氧化氫混勻。
終止液:1mol/L 硫酸溶液。
c.T-2毒素標準溶液:用甲醇配成1mg/mL T-2毒素貯備液,20℃冰箱貯存。于檢測當天,精密吸取貯備液,用稀釋液稀釋成制備標準曲線的所需濃度。
d.包被抗原:T-2毒素與載體蛋白-牛血清白蛋白的結合物。
e.抗體:抗T-2毒素的特異性單克隆抗體。
f.酶標二抗:兔抗鼠免疫球蛋白與辣根過氧化酶的結合物。
②測定方法
a.提取與凈化 稱取20g 粉碎并通過20目篩的樣品,置200mL 具塞錐形瓶中,加8mL 水和100mL 三氯甲烷-無水乙醇(4:1),密塞,振蕩1h,通過濾紙過濾,取25mL 濾液于蒸發皿中,置90℃水浴上通風揮干用50mL 石油醚分次溶解蒸發皿中殘渣,洗入250mL 分液漏斗中,再用20mL甲醇水(4:1)分次洗滌,轉入同一分液漏斗中,振搖1.5min,靜置約15min,取下層甲醇水提取液過層析柱凈化(層析柱的裝備:在層析柱下端與小管相連接處塞約0.1g 脫脂棉,盡量塞緊,先裝入0.5g 中性氧化鋁,敲平表面,再加入0.4g 活性炭,敲緊)。
將過柱后的洗脫液倒入蒸發皿中,并于水浴鍋上濃縮至干,趁熱加3mL 乙酸乙酯,加熱至沸,揮干,再重復一次,最后加3mL 乙酸乙酯,冷至室溫后轉入濃縮瓶中。用適量乙酸乙酯洗滌蒸發皿,并入濃縮瓶中。將濃縮瓶置95℃水浴鍋上,揮干冷卻后,用0.5mL 的稀釋液定容。
b.酶聯免疫吸附測定方法具體步驟 用包被抗原(4μg/mL)包被酶標板,每孔100L,4℃過夜;酶標板用洗液洗3次,每次3min后,加入不同濃度的T-2標準溶液(制作標準曲線)或樣品提取液(檢測樣品中的毒素含量)與抗體溶液(1:50000)的混合液(1:1,每孔100μL,該混合液應于使用的前一天配好,4℃過夜備用),置37℃,1h;酶標板洗3次,每次3min 后,加入酶標二抗每孔100μL,置37℃,1.5h;同上述洗滌后,加入底物溶液,每孔100μL,置37℃,30min;用終止液終止反應,每孔50μL,于450nm 處測定 OD 值。
c.結果判定與計算 樣品檢測孔所測得的OD值大于(或等于)陽性對照孔 OD 值,該樣品為陰性;反之,則為陽性。陽性樣品的毒素含量可根據下式計算。
T-2毒素含量
式中C——酶標板上所測得的T-2毒素的量,ng,根據標準曲線求得;
V1——樣品提取液的體積,mL;
V2——滴加樣液的體積,mL;
D——樣液的總稀釋倍數;
m——樣品質量,g
(2)直接法
①試劑
a.化學藥品:同間接法。
b.緩沖液系統:用間接法。
c.T-2毒素標準溶液:同間接法。
d.包被抗原:同間接法。
e.抗體:抗T-2毒素單克隆抗體與辣根過氧化酶結合物。
②測定方法
a.提取與凈化同間接法。
b.測定步驟用包被抗原(4μg/mL)包被酶標板,每孔100μL,4℃過夜;酶標板用洗液洗3次,每次3min 后,加入不同濃度的 T-2毒素標準溶液(制作標準曲線)或樣品提取液(檢測樣品毒素含量)與抗體辣根過氧化酶結合物溶液(1:100的混合液(1:1,每孔100μL,該混合液應于使用的前一天配好,4℃過夜備用),置37℃,1.5h酶標板洗3次,每次3min 后,加入底物溶液。每孔100μL,置37℃,30min。用終止液終止反應,每孔50μL,于450nm 處測定 OD 值。
c.測定結果與計算同間接法。