重組蛋白在E.coli中表達及純化

一. 實驗目的
1. 掌握重組蛋白誘導表達的方法；
2. 親和層析法純化His 標記的融合蛋白
二. 實驗原理
將目的基因連接在表達載體后，通過加入誘導劑IPTG誘導目的基因表達。表達載體除具有蛋白表達所需要的啟動子外，在終止子前有6個His編碼序列，便于蛋白的親和層析純化。
親和層析以蛋白質或生物大分子和結合在介質上的配基間的特異親和力為基礎。本實驗采用磁座和結合有Ni2+的磁珠在變性或非變性條件下對融合蛋白進行分離純化，只需通過“結合－清洗－洗脫”三個簡單的操作步驟就可完成。該系統可根據樣本量靈活調整磁珠用量，從而進行小量和大量蛋白純化，并且磁珠可以再生使用。
大體過程：
三. 試劑及器材
試劑：1.磁珠（濃度為25％，v/v）,儲存于100mM NiSO4溶液中，2－8℃。
注：磁珠不能干燥，不能離心，不能冰凍。
四. 實驗操作
（一）蛋白的誘導表達
1. 挑取含重組質粒的單菌落，接種于含相應抗生素的培養基中(Amp)，37℃振蕩培養過夜。
2. 次日以5％量接種，37 ℃培養至OD＝0.6時,加入IPTG （終濃度為0.1mM） 37℃誘
導表達2－3h.
3. 收集細菌（每人3ml，分兩次收集），5000rpm離心 3min。
PBS緩沖液清洗一次后同樣條件離心后再次收集菌體。每3ml菌液的菌體加入0.4ml
結合液懸浮。
（二）細菌的破碎
1. 加入溶菌酶4μl（100mg/ml）, 使得終濃度為1mg/ml, 放置冰浴中30～60min充分酶解。
2. 5000rpm離心5min，收集上清液4℃貯存備用,或接下一步層析純化。
（三）融合蛋白的親和層析
1. 將瓶內磁珠輕輕搖勻，取出200 μl（含50 μl凈磁珠）到離心管中，將離心管插入磁座，磁力吸附約1分鐘，棄除所有上清液。
2. 將離心管從磁座上取下，加入1 ml結合液，蓋好蓋子，搖勻磁珠后，插入磁座，磁力吸附約2分鐘，棄除所有上清液。
3. 重復步驟2兩次。
4. 將離心管從磁座上取下，加入預處理好的樣本，蓋好蓋 子，搖勻磁珠后，室溫下輕輕搖動10分鐘
5. 將離心管插入磁座，磁力吸附約3分鐘，棄除所有上清液。
6. 取下離心管，加入1 ml清洗液，蓋好蓋子，搖勻磁珠后，輕輕搖動1分鐘后插入磁座，磁力吸附約3分鐘，棄除所有上清液。
7. 重復步驟6兩次。
8. 取下離心管，加入150μl洗脫液，輕輕搖動5分鐘，插入磁座，磁力吸附約3分鐘，將上清液轉入到新的離心管中。
9.為了增加融合蛋白產量，重復步驟8洗脫1－2次。
10.洗脫蛋白后的磁珠按再生方法處理。
1. 用5倍凈磁珠體積的0.1M EDTA pH8.0,含0.5M NaCl重懸磁珠，室溫搖動1分鐘后，插入磁座至溶液澄清，棄上清。
2. 用5倍凈磁珠體積的2M NaCl重懸磁珠，室溫搖動1分鐘后，插入磁座至溶液澄清，棄上清。
3. 用5倍凈磁珠體積的1M NaOH重懸磁珠，室溫搖動5分鐘后，插入磁座至溶液澄清，棄上清。
4. 重復步驟3兩次。
5. 用5倍凈磁珠體積的70％乙醇重懸磁珠，室溫搖動1分鐘后，插入磁座至溶液澄清，棄上清。
6. 用5倍凈磁珠體積的超濾水重懸磁珠，插入磁座至溶液澄清，棄上清。
7. 重復步驟6一次
8. 用4倍凈磁珠體積的100mM NiSO4重懸磁珠，室溫搖動5分鐘。若接著要進行蛋白的分離純化，將離心管插入磁座棄上清，用5倍凈磁珠體積的結合液平衡三次后即可使用；若不進行蛋白的分離純化，將裝有磁珠和溶液的離心管豎直儲存于2－8℃。