飼料用酶制劑中木聚糖酶酶學性質的研究

目前國內外關于木聚糖酶的生產條件及其生產菌株的特性報道較多。為了掌握常用飼用酶制劑中木聚糖酶的酶學性質，我們對某商品復合酶制劑中所含的木聚糖酶進行了熱穩定性、最適pH值、最適反應溫度、底物針對性、不同金屬離子對其酶活的影響、反應進程曲線及其酶反應的未氏常數Km值等的測定，以期對常用的木聚糖酶的酶活測定、保存及應用有一定的指導意義。

1 材料與方法

1．l 實驗儀器

精密pH計：±0.01pH；電子天平：d＝1mg；紫外分光光度計UV－1601；恒溫水浴鍋；蠕動泵；紫外檢測器；分布收集器；ф2．6 cm×100 m色譜柱。

1．2 實驗材料

某商品酶制劑

1．3 酶活測定

酶活力測定：采用DNS法

酶活單位定義：在50℃、PH值為5．0條件下，每分鐘產生 1μmol還原糖所需酶量定義為1個酶活單位。

測定底物：1.0％樺木木聚糖（SigmaX-0502）；

酶液制備：準確稱取1.000g該酶制劑，用0.2mol／L的醋酸－醋酸鈉緩沖液（pH值為5．0）定容至500mL，搖勻，靜署提取，過濾后取濾液并稀釋至適當倍數備用。

標準曲線：分別吸取1．0mg／mL的木糖標準液0、0.2、0．3、0．4、0．5、0.6、0．7、0．8和1．0mL，依次加入試管中，以蒸餾水補加到2．0 mL。加DNS試劑3mL，于沸水中沸騰7min（樣品放人重新沸騰時算起），取出后冷卻，加入蒸餾水10mL混勻，于550nm處進行比色測定，用空白管調零點，記錄光密度值，以木糖mg數為縱坐標，光密值為橫坐標繪制出標準曲線。

酶活測定：取25mL具塞試管，加入1．0mL木聚糖底物，于50℃保溫5min，然后精確加入1．0mL酶液，準確反應30min后測定酶活，空白管先加1mL酶液和3mL DNS試劑，沸水浴3 min，再加lmL木聚糖底物搖勻后沸水浴顯色7 min，其余同前。

1．4 實驗試劑

0．2mol／L醋酸－醋酸鈉緩沖液（pH值為5．0）、DNS試劑、10mg／mL木聚糖溶液。

2 實驗設計

2.1 木聚糖酶熱穩定性研究

2.1.l 干熱處理對木聚糖酶活的影響

在65、75、85和95℃恒溫干燥箱中將樣品處理10min，立即提取，測定酶活，并以未經干熱處理的樣品中的酶活為100，干熱處理后的酶活為處理前酶活的百分數，即為該酶經干熱處理后的剩余酶活。

2．1．2 濕熱處理時間對酶活的影響

準確稱取1．000 g樣品加入10％的水（加水后總含水量約17％），充分攪拌后蓋嚴，于85℃恒溫干燥箱中處理25、5．0、7．5和10min，立即提取并測定其酶活，以未經濕熱處理的酶活為100，濕熱處理后的酶活為處理前酶活的百分數，即為該酶經濕熱處理后的剩余酶活。

2．2 木聚糖酶最適pH值的研究

用0．1M檸檬酸和0．2 M磷酸氫二鈉溶液配制pH值范圍為3～7的檸檬酸－磷酸氫二鈉緩沖液，在不同的反應pH值條件下測定其酶活，以酶樣最大吸光度的酶活為100。在其他條件下的酶活為最大吸光度酶活的百分數即為該酶在此pH值條件的相對酶活。

2．3 木聚糖酶最適反應溫度的研究

在最適pH值條件下，分別設置不同的反應溫度，并測定該條件下的木聚糖酶活，以酶樣最大吸光度的酶活為100，在其它溫度下的酶活為最大酶活的百分數即為該酶在其它溫度下的相對酶活。

2．4 木聚糖酶底物針對性實驗

在最適pH值及最適溫度條件下，分別以1．0％樺木木聚糖和1．0％燕麥木聚糖作為底物，測定在不同底物下的酶活。并以樺木木聚糖為底物時的酶活為100，燕麥作為底物時的酶活為樺木木聚糖作為底物時酶活的百分數，即為其相對酶活。

2．5 不同金屬離子對木聚糖酶酶活的影響

用pH值為5．0的醋酸－醋酸鈉緩沖液配制的10mg／mL木聚糖（SingmaX－0502）溶液中分別加入不同化合物，并使各離子終濃度為5mmol／L。以不加任何離子的木聚糖液作為底物時所測出的酶活值規定為100％，其它底物條件下所測出的酶活力為其百分數，即可得到該酶在其它條件下的相對酶活。

2.6 木聚糖酶反應進程曲線的測定

將木聚糖粗酶液用30％（NH4）2SO4沉淀，離心15min去沉淀，取上清液；上清液再用60％（NH4）2SO4沉淀，離心后將沉淀溶解于0．2mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH值為5．0）中，上Sephades-G100色譜柱進行分離純化，用相同的緩沖液洗脫，收集含水聚糖酶的組分，凍干得純酶。用純化得到的酶進行如下的反應進程及Km值測定：

按照反應時間20、40、60、70、80、90、100min進行分組，每組分別添加0．2、0．4、0.6、0．8和1．0mL經過適當稀釋的木聚糖酶，不足部分用醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH值為5．0）補足至最終體積為l mL，按體積比1∶l加入1．0％的木聚糖。50℃水浴條件下按相應的反應時間進行反應，以相對應的先滅活酶液加3mL DNS和1mL 10mg／mL的木聚糖作對照，完畢后在550 nm處進行測定。以反應時間（min）為橫軸，反應量(μmol)為縱軸，可給出不同酶添加量時的反應進程曲線。

2.7 木聚糖酶Km值的測定

取8支試管依次編號，在每管中加入不同體積的1％木聚糖溶液，不足部分用0．2 mol／L醋酸－醋酸鈉緩沖液（pH值為5．0）補足，使底物體積為1mL，置于50℃預熱；向每管中準確加入適當稀釋的1mL木聚糖酶液，精確反應30min后進行酶活測定。然后以1／[S]為橫坐標，1／v為縱坐標作圖，得出Km值。

3 實驗結果

3．l 木聚糖酶的熱穩定性研究

3．1．l 干熱處理對木聚糖酶活的影響

經過不同溫度條件下的干熱處理對木聚糖酶活的影響實驗，得到實驗結果如下：

表1 干熱處理對木聚糖酶活的影響

從實驗結果可以看出，該木聚糖酶對于處理溫度不超過85℃時其耐干熱處理的能力較強。

3.l.2 濕熱處理時間對酶活的影響

表2 濕熱處理時間對酶活的影響

在85℃下采用不同時間進行濕熱處理得到結果如表2所示。

可以看出，濕熱處理對酶活的影響同干熱處理相比要大得多，這是由于在濕熱處理條件下，更易使蛋白質變性。

3．2 木聚糖酶最適pH值的研究

可以發現，該木聚糖酶在pH值為5．00的條件下，酶活力最高，因此，可以確定該木聚糖酶的酶活測定的最適pH值為5．00。

3．3 木聚糖酶最適反應溫度的研究

從實驗結果中可以發現，反應溫度對該木聚糖酶酶活的測定影響很大，在50℃時的相對酶活為100％，而在60℃時其相對酶活卻僅為50℃時的23.35％。所以，我們選擇木聚糖酶的最適反應溫度為50℃。

3．4 木聚糖酶底物針對性實驗

木聚糖酶是一種復合酶，含有多種酶蛋白組分，從已有的研究結果可以發現，能產生水聚精酶的微生物至少有20種，而且不同的微生物產生的木聚糖酶通常也是不同的，另外底物中作用成份含量及分子結構的不同，也必定會造成酶活測定的不一致。陸文清等人進行過底物對酶活測定的影響實驗，他們選用燕麥木聚糖和樺木木聚糖作為底物，發現底物不同時測得木聚糖酶活相差很大。為此，我們進行了該木聚糖酶針對不同底物進行了酶活測定實驗，結果如表3所示。

表3 不同底物對木聚糖酶活測定的影響

實驗結果資明：該本聚糖酶對于樺木木聚糖的針對性比燕麥木聚糖好。

3．5 不同金屬離子對木聚糖酶酶活的影響

表4 不同離子或化合物對木聚糖酶活性的影響

可以看出， Mg2+、 Cu2+、Mn2＋、Zn2＋、Fe3＋對于木聚糖酶的活性有抑制作用，其中Cu2＋的抑制作用最強，酶活損失近70％，其次為Mn2＋、Fe3＋、Mg2＋、Zn2＋，酶活損失約21．l％～38．8％，Fe2+對木聚糖酶活影響不大；此外，Na+、K+及（NH4）2SO4對酶活性有一定的激活作用。

3．6 木聚糖酶反應進程曲線的測定

從圖3木聚糖酶的反應進程曲線中可以看出，該水聚糖酶液添加量為0．2～1.0mL、時間為60min之內，反應進程曲線均呈線性，所以在這個范圍內進行測定，求出的反應速度為最大反應初速度，這有利于酶活的正確測定。

同樣地，以酶液添加量為橫坐標，反應速度為縱坐標，可以作圖得到木聚糖酶的酶濃度曲線如下：

由圖4可以發現，該水聚糖酶在反應時間為60min范圍之內時，線性關系良好，而在測定時間超過60min后，反應速度開始下降，因此，此濃度曲線從另一個方面也驗證了上面的反應進程曲線。

3.7 木聚糖酶Km值的測定

米用Lineweaver-Burk法作圖如下：

將直線延伸，可求得水聚糖酶的Km＝4.485（mg／mL）。

4 討論

本文研究的該木聚糖酶最適pH值和最適溫度與其他報道的木聚糖酶相近似，且耐熱性能較好。經模擬制粒過程后（85℃、17％水分、處理2．5 min），仍保持較高的酶活（83．10%）。另外，Cu2+、Zn2+、Mn2+和Fe3+對本木聚糖酶有抑制作用；而Na+、K+及（NH4）2SO4對其酶活有一定的激活作用。

測得該本聚糖酶的Km值為4.485mg／mL，與其他來源的木聚糖酶相比，Km值較低，這說明，該木聚搪酶對木聚糖的親和性較高。

從該木聚糖酶的特性看，動物腸道內的溫度、pH值對其活性影響不大，而且能耐受制拉過程中的高溫，這使其在動物飼料中的運用具有獨特優勢。