70年代新發展的層析法。其特點是：用高壓輸液泵，壓強最高可達5000psi（相當于34個標準大氣壓）。用直徑約3～10微米的超細支持物裝填均勻的不銹鋼柱。常用的支持物是在玻璃小珠上涂一層1～2微米的二氧化硅，經硫酰氯反應生成Si—Cl，進一步連接疏水的烷基，如Si—C18H37，或陽離子交換基團—Si（CH2）n—C6H4SO3H，或陰離子交換基團—Si（CH2）nNH2。
這種支持物能承受很高的壓力，化學性能穩定。用不同類型支持物的HPLC，可做吸附層析、離子交換層析和凝膠過濾層析。其分析微量化可達10-10克水平。但用于制備，可以純化上克的樣品。展層時間短，一般需幾分鐘到10余分鐘。其分析速度、精確度可與氣相層析媲美。HPLC適于分析分離不揮發和極性物質。
而氣相層析只適用于揮發性物質，兩者互為補充，都是最為理想的層析法。HPLC配有程序控制洗脫溶劑的梯度混合儀，數據處理的積分儀和記錄儀等電子系統，成為一種先進的分析儀器，在生物化學、化學、醫藥學和環境科學的研究中發揮了重要作用。