3.2 糖基化位點確定
ADC 單抗蛋白與其他單抗蛋白相同，也都包含 N-糖基化修飾，一般發生在保守序列 NXS 或 NXT 中（X 為除脯氨酸外的任意氨基酸）。在糖鏈完整的情況下，直接進行 trypsin 酶解，我們在搜庫時進行 G0F 糖基化可變修飾設定，可以直接獲得該 N 糖基化位點：重鏈氨基酸序列 EEQY N261STYR 中的 N261 位點，下圖為該肽段的 G0F 串級質譜圖，除了圖中黃色和藍色代表的該肽段的 b、y 碎片離子外，紅色圓圈所示的為該糖肽的糖特征碎片離子（低 m/z 端）和糖肽碎片離子（高 m/z 端），從而可以準確確證該糖肽和糖基化位點的存在。
圖 7. 重鏈氨基酸序列 EEQYN261STYR 的串級質譜圖
3.3 ADC 藥物結合位點確定
根據 Proteome Discovery 軟件搜庫結果顯示，我們發現在賴氨酸結合藥物分子的肽段的串級質譜圖中存在特征碎片離子 453.20、485.23 和 547.21，因此我們通過這些特征碎片對所有的可能發生 ADC 結合的肽段的串級質譜圖進行人工確認，最終準確確認了輕鏈中 2 個賴氨酸位點和重鏈中 7 個賴氨酸位點發生了 ADC 小分子藥物結合，具體位點如下圖（圖 8）所示，并且以其中一條肽段為例，給出了 ADC 結合肽段的串級質譜圖（圖 9），紅色圈表示 ADC 特征碎片離子。同時我們也觀察到 ADC 藥物結合后的肽段的疏水性比較強，色譜流出比較靠后，這一現象完全符合理論推測。
圖 8. ADC 藥物小分子結合位點示意圖
圖 9. ADC 結合肽段 VSNKALPAPIEK 的串級質譜圖
4. 結論
本文通過 Q-Exactive 質譜建立了 ADC 單抗藥物的整體分子量測定、氨基酸序列鑒定、糖基化位點和 ADC 藥物結合位點確認的分析方法，為 ADC 單抗藥物研發分析和實時生產檢測提供了高效、快速的分析平臺。實驗結果表明 Q-Exactive 串聯質譜儀，憑借其超高的分辨率，超快的掃描速度，超高的質量精度、超低的靈敏度和超大的動態范圍，極大地完善和推動了 ADC 單抗藥物的鑒定分析。