CPSA分會：LCMS在生物分析中的應用

　　2012年4月25~27日，第三屆中國上海化學與藥物結構分析會議 (CPSA Shanghai 2012)在上海浦東新區淳大萬麗酒店召開，來自國際知名藥企、跨國大制藥公司、中國CRO、生物醫藥研究所和高校的高管、專家、學者百余人參加了本次會議。其中在4月25日的分會上，舉行了有關LC-MS在生物分析應用中的研討會，來自Johnson and Johnson(強生)公司的Wenying Jian女士和Naidong Weng先生，來自(WuXi APPTEC)藥明康德公司的Rorbert Coldreck先生分別做了相關的報道。

大會現場

Johnson and Johnson(強生)公司的Naidong Weng先生

　　首先，做報告的是來自Johnson and Johnson(強生)公司的Naidong Weng先生帶來的報告是“Overview of GLP principles and key elements of bioanalytical method validation”(GLP原理的綜述和生物分析方法驗證的關鍵要素)。

　　Naidong Weng先生首先講到良好的實驗室規范研究，得到了毒理學研究(毒代動力學，TK)的支持，得到了其他藥物的安全性相關研究的支持。而在非GLP的研究中，GLP原則仍然應用于許多研究領域，如臨床研究中的生物等效性、生物利用度和新藥的應用，和生物分析方法驗證等方面。GLP的評價標準是衡量一個實驗室設施合理性的重要工具，并確保數據完整性。Naidong Weng先生指出，GLP是受到了行業的生物分析方法驗證的指導，歐洲藥品管理局(EMEA或EMA)生物分析方法驗證指引，定量生物分析方法驗證，ICH的驗證分析程序，藥品質量體系等影響的。

　　另外，Naidong Weng先生還為大家報告了生物分析方法驗證的關鍵要素。在這里他介紹了定量下限(6個數量級)、LLOQ(定量下限)下的信噪比，準確度和精密度等在生物分析方法驗證中的影響。他還指出：在建立的回歸模式中，LC-MS/MS檢測方法在很大的一段濃度范圍內都產生線性響應，且回歸擬合合理、重復性良好。

　　在接下來的報告中，Johnson and Johnson(強生)公司的Naidong Weng先生還帶來了“Technical considerations for bioanalytical method development, sample analysis, and trouble-shooting”(生物分析方法開發、樣品分析及故障排除過程中的技術因素)。他從生物分析方法的生命周期、方法因素、樣品的制備和色譜分離等幾個方面做了詳細的講解。

　　Naidong Weng先生指出生物分析方法的生命周期是從方法的開發到方法的驗證，再到方法的完善，最后是樣品分析。方法思路中的樣品制備方法有蛋白質沉淀法、液相萃取法、固相萃取法和在線分離等方法，色譜分離包括反相柱(C8，C18)、離子交換、離子對、HILIC柱和正相柱，檢測方法包括MS、MS/MS、HRMS等。

　　Naidong Weng先生說：樣品的制備是為了消除干擾、消除并減少雜質的影響、富集目標物并提高其檢出限。他還道出了分離的重要性，如葡萄糖醛酸和谷胱甘肽共軛共軛代謝產物需要從分析物中分離出來，因為他們會打破待測源，造成分析偏差;異構體、等壓同位素和內源性物質的干擾在分析中需要排除;磷脂和配料載體如PEG400的物質，需要從分析物中分離出來，否則他們會可能導致離子抑制。最后，Naidong Weng先生還講述了利于色譜分離的方法：更高的柱效(高塔板數和低塔板高度)，當在高流速的情況下，較小的粒徑的柱子可以提高柱效(正如在高倍壓情況下，UPLC就會發揮相應的作用);更好的色譜分離峰(高的峰容量)，這與柱子的本身的分離性、固定相的物質、流動相的組成、和有效的優化柱子有關，這也需要色譜和分子好的維護。

(WuXi APPTEC)藥明康德公司的Rorbert Coldreck先生

　　接下來的報告是來自(WuXi APPTEC)藥明康德公司的Rorbert Coldreck先生，他報告的題目是“Practical considerations and preparations for bioanalytical laboratory audit and inspection”(生物分析實驗室的審計和檢查工作中的實際因素和準備工作)。

　　關于GLP

　　首先，Rorbert Coldreck先生首先講了生物分析實驗室中GLP標準，GLP包括臨床的和非臨床的研究。其中在臨床研究中，需要具體的臨床試驗協議、BA實驗室協議和報告、QA的參與和研究主任(BA的員工)。非臨床研究中，需要具體的研究協議、測試設備時的研究主任、主要研究者(PI)和有貢獻的科學家(CS)、PI/CS的報告和QA的參與。Rorbert Coldreck先生還舉了一些例子來敘述生物分析實驗室的GLP標準。

　　之后，Rorbert Coldreck先生對GLP的檢查過程中的檢查形式、分類、管理行政行為一一做了分析。

　　GLP檢查的準備工作

　　GLP檢查的準備工作包括設備的準備，如檢閱組織結構圖、加強檢驗過程等;需要注意的地方有工作臺的干凈整潔、標簽時準確完整的、文件審查是當前的等等;監管檢查時可以做的和不能做的：要采取一個友好合作的態度、要誠實、回答問題時要簡潔，不要猜疑、撒謊、緊張，更不要說可能或沒有發生的事情;開展GLP檢查，建立初次的接觸與督察，協調計劃的檢查，提供要求的文件等。

　　容易不符合規定的部分有：分析結果沒有文件;藥物樣品的接收和處理的不足或沒有書面程序;所有的數據點已經失效，或者可以以不記錄在案，作為一個科學合理的理由拒絕;非技術人員進行分析程序;樣品被允許長時間的不正確儲存等等。

　　來自Johnson and Johnson(強生)公司的Wenying Jian女士帶來了，“Special considerations for LC-MS bioanalysis of proteins and peptides”(生物質譜技術在分析蛋白質和多肽時的特殊解決方案)

　　Wenying Jian女士在會上提到，質譜技術分析蛋白和多肽時，分為三個步驟，分別是樣品的制備、液相分離和質譜檢測。

　　在樣品的制備過程中常用到的方法有PPT法、固相萃取法、豐富的蛋白質消耗、免疫親和富集和消化等方法。一般情況下，當血漿中的蛋白質或肽鏈MW<10,000Da時，使用PPT法和固相萃取法;當蛋白質或肽鏈MW>10,000Da時，使用豐富的蛋白質消耗和免疫親和富集，然后再消化的方法。

　　在液相分離過程中常用的方法有反相高效液相色譜、HILIC色譜柱分析法、單片、熔芯、離子交換、2D-LC、上線萃取等方法。在一般情況下，給目標肽鏈或蛋白質定量時，C18柱用于小的肽鏈，C12、C8柱用于大的肽鏈，C4柱用于蛋白質。當希望從較多干擾物中較好的分離時，可以使用2D的方法。

　　在質譜檢測中，一般會使用MRM做標志的肽鏈和完整蛋白質，MS用于完整蛋白質的分析，還有MRM3等方法。Wenying Jian女士講到質譜分析中面臨著很多挑戰，如質荷比值可能超出儀器的檢測限;多帶電方式和廣泛的同位素分布限制了其靈敏度;在電離效率下高度的變異性和不同的帶電狀態下的分布情況;解離效率差等等。

　　最后，Wenying Jian女士表示目標蛋白質或肽鏈的樣品制備過程是個瓶頸;在整個肽鏈或蛋白質分析過程中，最好使用穩定的同位素標記物作為內標物;特別需要注意的細節有吸附、穩定、溶解度、PTM、特定蛋白結合等過程。

　　隨后，Wenying Jian女士繼續為大家講解了“Challenges and solutions for LC-MS analysis of biomarkers”(液質聯用技術分析生物標志物的挑戰和解決方案)。

　　首先，Wenying Jian女士向大家闡述了生物標志物的定義，她說：“生物標志物作為一項指標，在正常的生理過程、治病過程、干預治療的藥理反應客觀的測量和評價過程中，具有至關重要的作用。”

　　生物標志物的生物分析方法

　　生物分析檢測中，STD和QC樣品理想中的制備方法，是使已知數量的待測尖峰信號進入到預定的生物基質中去。然而，對于內源性化合物，生物基質本身通常包含一個未知的待測物質，這使得它不適合參與樣品的制備了。克服這個問題的方法可以是：分析物本身，基質本身;分析物本身，基質替代物;基質本身，分析物替代物;或者是酶活性的測定。

　　“Fit-for-purpose”

　　目前，有沒有監管指導生物標志物檢測驗證和實施。“Fit-for-purpose”是共同為業界采用小分子生物標志物檢測的指導和PK研究的白皮書。其中它有很多方法是得到了共識的，它作為生物標志物的數據，使用越來越先進的臨床或其他關鍵業務的決策增加驗證使用;嚴謹的驗證，提高了作為生物標志物的數據使用越來越先進的臨床或其他關鍵業務的決策;數據顯示準備申請檢測的可靠性。

　　“Fit-for-purpose”的原理來源于納入或排除的驗證實驗、靈活的實驗設計、擴大或縮緊驗收標準。

　　在會后的問答環節中，與會者踴躍提問，現場氣氛十分熱烈。