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  • 發布時間:2021-06-29 16:36 原文鏈接: CRISPR分子診斷技術(四)

    19    由于其高靈敏度和特異性,CRISPR診斷技術或CRISPR-Dx可以有很多用途:病毒檢測和病毒亞型區分,病菌識別和耐藥性基因確認,即時檢測(POCT), 患者基因分型,以及癌癥突變分析和液體活檢。這篇論文也初步展示了CRISPR-Dx在這些方面的應用前景。

    圖片來源:參考資料3

    20   比如,利用SHERLOCK,張鋒團隊從患者的血清(S)或尿液(U)里檢測到濃度低至每微升含單一拷貝的塞卡病毒(ZIKV)。美中不足的是,在用SHERLOCK檢測之前,需要從患者的體液樣品中提純病毒RNA,這影響了該方法的便捷性。

    圖片來源:參考資料10

    21    SHERLOCK也可被用在癌癥液體活檢中,從(模擬)患者的游離DNA (cfDNA) 樣品中檢驗出只占0.1%的基因突變(BRAF V600E)。也就是說,SHERLOCK的特異性可達到單堿基分辨度。要想達到如此高的特異性,crRNA的設計很關鍵。

    圖片來源:參考資料10

    22    2017年5月,在張鋒團隊的Science論文發表不到一個月后,Doudna團隊又在Molecular Cell上發表了一篇論文。文中發現所有的Cas13a可以被分為兩個亞族。和不同亞族Cas13a配套的crRNA具有不同的輔助序列,激活后Cas13a-crRNA對同一報告RNA的非特異剪切活性也有差別。作為兩個亞族的代表,LbaCas13a更易剪切5個A串成的報告RNA,而LbuCas13a偏愛剪切5個U串成的報告RNA。兩個Cas13a亞族的區別,使它們可以被用來構建多重高通量診斷分析,即在一次測試中可以同時檢驗多個靶分子。

    圖片來源:參考資料6

    23   2018年2月到4月是CRISPR-Dx技術的爆發期。Doudna實驗室和張鋒實驗室各有一篇論文于2月15日被Science在線發表。在4月27日的紙版的Science中,這兩篇論文連同張鋒團隊的另一篇論文 “back-to-back-to-back”一起發表。在Doudna的Science論文中,他們找到了Cas13a在DNA分子識別、剪切和降解上的相應蛋白——Cas12a。Cas12a不是一個新蛋白,而是張鋒團隊于2015年9月發現并命名的Cpf1(圖8)。

    圖片來源:參考資料2和10

    24   Cas12a-crRNA識別單鏈或雙鏈DNA。一旦被激活后,Cas12a非特異性地剪切、降解單鏈DNA。他們借鑒了SHERLOCK技術,也引進了RPA步驟。RPA + Cas12a成為新的核酸分子檢驗技術,被命名為DETECTR,與英文的“探測器”諧音。與SHERLOCK相比,DETECTR省掉了從擴增后的DNA產物轉錄到RNA這一步。

    圖片來源:參考資料2和10


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