實驗材料 DNA片段
試劑、試劑盒 TE緩沖液
儀器、耗材 離心機 恒溫水浴取液器電泳儀電泳槽紫外觀測儀
實驗步驟
一、EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ單酶切及雙酶切
1. 取2支干凈、滅菌新Eppendof管，分別按下表加入
A（μl） B（μl）
滅菌水 13 13
EcoR Ⅰ緩沖液 2 0
Hind Ⅲ緩沖液 0 2
λDNA （或質粒DNA ） 4 4
EcoR Ⅰ 1 0
Hind Ⅲ 0 1
總體積 20 20
2. 37℃保溫1-4小時。
3. 保溫結束后65-70℃10 min 滅活酶（如為熱穩定性酶，則用氯仿抽提）。
4. 取2 μl 左右的反應液加入2 μl 電泳加樣緩沖液，電泳。
二、EcoR Ⅰ、Hind III雙酶切
1. 取一支干凈、滅菌Eppendof管，按下表加入各種試劑
加入試劑 體積（μl）
滅菌水 12
MULT buffer 2
λDNA（或質粒DNA） 4
EcoR Ⅰ 1
Hind Ⅲ 1
總體積 20
2. 37℃保溫1-2小時。
3. 保溫結束后65-70℃10 min 滅活酶（如為熱穩定性酶，則用氯仿抽提）。
4. 取2 μl 左右的反應液加入2 μl 電泳加樣緩沖液，電泳。
注意事項
1. 樣品加入次序為水、緩沖液、DNA最后為酶，不應顛倒。
2. 加酶步驟要在冰浴中進行，在加酶前應先將水、緩沖液及待切DNA混勻。
3. 反應體積中水的量要盡量少，即反應體系的體積要盡量少，一般水解0.2~1 ug 模板DNA時，應將體積控制在20~30 ul 內。但要保證所加酶的體積不高于總體積的1/10，因為限制性內切酶是保存于50%甘油中的，如加酶體積高于總體積的1/10，則反應液中甘油濃度將大于5%，而此濃度將抑制內切酶活性。
4. 為了控制反應體積和促進反應進行，要求模板DNA的濃度應很高，否則反應體系中DNA濃度太低則將引起酶反應動力學改變、降低酶解效果，此時不得不增加反應體積；而一般為了增加DNA儲藏的穩定性，DNA多保存在TE緩沖液中，如反應體系中過多加入模板DNA溶液則勢必造成反應體系中EDTA濃度升高，而對酶產生抑制。因此如底物DNA濃度過低則應進行濃縮。