可以采用幾種策略來進行外源ＤＮＡ片段和質粒載體的連接。對此，可依據外源ＤＮＡ片段未的性質，以及質粒載體與外源ＤＮＡ上限制酸切位點的性質來作出選擇。
帶有各種未的外源ＤＮＡ的克隆方法見下表：
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外源ＤＮＡ片段所帶未端 克隆的要求 說明
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平端 要求高濃度的ＤＮＡ和連接酶
1)非重組體克隆的背景可能較高
2)質粒和外源DNA拼命處的限制酶切位點消失
3)重組質粒會帶人外源DNA的串聯拷貝
用兩種限制酶消化后 需純化
1)質粒與外源DNA拼命處的限制酶切位點常可保留不同的突出端
2)非重組體克隆的背景較低質粒體以盡量提高連接效率
3)外源DNA只以一個方向插入到重組質粒中
相同的突出端 線狀質粒DNA常用磷酸酶處理
1)質粒與外源DNA接合處的限制酶切位點常可保留
2)外源DNA會以兩個方向插入
3)重組質粒會帶有外源DNA的串聯拷貝
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１．帶有非互補突出端的片段
用兩種不同的限制酶進行消化可以產生帶有非互補突出端的片段，刀就是最容蜴 克隆的片段。常用的大多數質粒載體均帶有由幾個不同限制酶的識別序列組成的多克隆位點。由于現有的多克隆位點如此多樣，因而幾乎總是能找到一種帶有與外ＤＮＡ片段未匹配的限制切位點的載體。于是，采用所謂的定向克隆即可將外源ＤＮＡ片段插入到載體當中。例如：載體pUC19用BamHl和Hind－Ⅲ進行消化，然后，通過凝膠電泳或大小排阻凝膠層析純化載體大片段，以使同芤下來的多克隆位點 缺小片段分開。于是，這一載體就可以同有與BamHl和ＨindⅢ所切出未端相匹配的粘端的外源ＤＮＡ區段相連接。用得到的環狀重級體化大腸桿菌，檢查氨芐青霉素抗性。由于HindⅢ和BomHI的突出端不互補，載體片段不能有效地環化，所以轉化大腸桿菌的效率也極低。因此，大多數具有氨芐表霉素抗性的細菌都含有帶外源ＤＮＡ區段的質業，外源ＤＮＡ區段成為連接HindⅢ和BamHI位點的橋梁。當然，可以根據特定的外源ＤＮＡ區段來改變限制酶的組合方式。
如要制備定向克隆載體，它盡量避免使用大多克隆位點上彼此直接相鄰的限制酶切位點。這些位點中的一個被切開以后，第二個位點應位于線狀ＤＮＡ分子一端的幾個堿基對之內，這樣過于靠近末端，不利于多種限制酶的有效切割。正因為如此，所以務必檢查兩種限制酶對載體的消化是否完全。可采用以下兩種檢查方法： １）用兩種限制酶中的一種對載體進行消化，當所用限制酶的最撻緩沖液對離子強度的要求有不同時，應使用所要求的鹽濃度較低的酶。消化完后，應通過凝膠電泳對一小份ＤＮＡ進行檢查。如所有質粒ＤＮＡ均從環狀轉變為線狀分子時，適當調整鹽濃度，并加入第二種酶。同時，另行設立一個預實驗，其中含有環狀質粒ＤＮＡ，并只加兩種限制酶中的第二種。當預實驗中的所有ＤＮＡ都轉變為線狀（由凝膠電泳確定）時，通過凝膠電泳或尺墳排阻凝膠層析純化質粒ＤＮＡ大片段。\par ２）圖1.7所示的是檢查消化反應完全程度的一種更為嚴格的方法。對用第一個限制酶切割的一小份ＤＮＡ進行末端標記，經離盡柱層析法純化后，與未標記的線狀ＤＮＡ混合。然后用第二個酶消化，完全消化可使ＤＮＡ小片段釋放，它應帶有50％的放射性活度，這可通過層析或通過凝膠電泳和放射自顯影加以檢測。
２。帶有相同末端（平端或粘端）的片段
帶有相同末端（平端或粘端）的外源ＤＮＡ片段必須克隆到具有匹配末端的線狀質粒載體中。在連接反應中，外源ＤＮＡ和質粒都可能發生環化，也有可能形成串聯寡聚物。因此，必須仔細調整連接反應中兩個ＤＮＡ的濃度，以便使“正確”連接產物的數量達到最佳水平（見本節三）．此外，常常使用堿性磷酸酶去除5'磷酸基團以抑制質粒ＤＮＡ的自身連接和環化。在體外連接反應中，僅當一個核苷酸含5'磷酸基團而另一個含3'羥基時，Ｔ４噬菌體ＤＮＡ連接酶可催化相鄰核苷間形成磷酸二酯健。用細菌堿性磷酸酶(BAP)或牛小腸堿性磷酸酶(CIP)去除線狀ＤＮＡ兩端的5'磷酸可以最大限度的地減少質粒ＤＮＡ區段可有效地與去磷酸化質粒ＤＮＡ相連接，產生一個含有兩個切口的開環分子（圖1.8）。因為環狀ＤＮＡ（即使是帶切口的環狀ＤＮＡ）的轉化效率比線狀ＤＮＡ高得多，所以大多數轉化體都含有重組質粒。
３．帶有平端的片段
外源ＤＮＡ片段帶平端時，還有一樁切外生枝的麻煩事，這就是蛺端的連接效率比起帶有突出互襪末端的ＤＮＡ要低得多。因此，涉及平端分子的連接反應所要求的Ｔ４噬菌體ＤＮＡ連接酶的濃度和外源及質粒ＤＮＡ的濃度都要高得多。還要說明的是，加入低濃度的如聚乙二醇一類的物質，常可提高這類反應的效率。
（二） 質粒載體和外源ＤＮＡ中限制酶切位點的性質
如今，質粒載體中限制酶切位點的種類極為繁多，因而通常都有可能找到某種帶限制酶切位點恰恰與外源ＤＮＡ片段本身毫無二致的載體。這就具備一個不可比擬的優點，也應是可以用相應的限制酶消化重組質粒崦回收外源ＤＮＡ。另一種方案，則是把片段插入到載體中能產生匹配末端的任何位點中。例如，識別不同的六核苷酸的限制酶BamHl和BglⅡ產生具有相同突出末端的限制酶切片段，這樣用BglⅡ消化而制備的外源ＤＮＡ片段可以克隆到用BanHl消化的質粒中。這通常會使接合序列不能被曾用于外源ＤＮＡ或制備載體的任何一種酶所切開。然而很多清況下，用切點位于多克隆序列側翼的限制酶進行消化，可將片段從重組質粒中摘出。偶爾在質粒的以及外源ＤＮＡ兩端的限制酶切位點之間，不可能找到“門當戶對”的搭配關系。這時可用下面兩種方案加以解決：
１）在線狀質粒末端和（或）外源ＤＮＡ片段的末端接上合成在接頭或銜接頭。
２）在得到控制的反應條件下，用大腸桿菌ＤＮＡ聚合酶I Ｋlenow片段部分補平帶3'凹端的ＤＮＡ片段。如第九章所討論，這樣常可以使那些不相匹配的限制酶切位點轉變為互補末端，從而促進載體和外源ＤＮＡ的連接。因為部分補平反應消除了同一分子兩端彼此配對的能力，故連接反應過程中環化和自身寡聚化的機會也會有所降低（Hung和Wensink,1984;Zabarovsky和Allikmets,1986）。
（一）外源ＤＮＡ和質粒載體的連接反應
外源ＤＮＡ片段和線狀質粒載體的連接，也就是在雙鏈ＤＮＡ５'磷酸和相鄰的3'羥基之間 形成的新的共價鏈。如質粒載體的兩條鏈都帶5'磷酸，可生成４個新的磷酸二酯鏈。但如果質粒ＤＮＡ已去磷酸化，則吸能形成２個新的磷酸二酯鏈。在這種情況下產生的兩個雜交體分子帶有２個單鏈切口（圖1.8），當雜本導入感受態細胞后可被修復。相鄰的５'磷酸和３'羥基間磷酸二酯鍵的形成可在體外由兩種不同的ＤＮＡ連接酶催化，這兩種酶就是大腸桿菌ＤＮＡ連接酶和Ｔ４噬菌體ＤＮＡ連接酶。實際上在有克隆用途中，Ｔ４噬菌體ＤＮＡ連接酶都是首選的用酶。這是因為在下沉反應條件下，它就能有效地將平端ＤＮＡ片段連接起來。
ＤＮＡ一端與另一端的連接可認為是雙分子反應，在標準條件下，其反應速度完全由互相匹配的ＤＮＡ末端的濃度決定。不論末端位于同一ＤＮＡ分子（分子內連接）還是位于不同分子（分子間連接），都是如此。現考慮一種簡單的情況，即連接混合物中只含有一種ＤＮＡ，也就是用可產生粘端的單個限制酶切割制備的磷酸化載體ＤＮＡ。在瓜作用的底物。如果反應中ＤＮＡ濃度低，則配對的兩個末端同一ＤＮＡ分子的機會較大（因為ＤＮＡ分子的一個末端找到同一分子的另一末端的概率要高于找到不同ＤＮＡ分子的末端的概率）。這倦，在ＤＮＡ濃度低時，質粒ＤＮＡ重新環化將卓有成效。如果連接反應中ＤＮＡ濃度有所增高，則在分子內連接反應發生以前，某一個ＤＮＡ分子的末端碰到另一ＤＮＡ分子末端的可能性也有所增大。因此在ＤＮＡ濃度高時，連接反的初產物將是質粒二聚體和更大一些的寡聚體。Dugaiczyk等(1975;同時參見Bethesda Res,Lab.出版的Focus第2卷，第２、３期合刊）從理論上探討了ＤＮＡ濃度對連接產物性質的影響。簡而言之，環化的連接產物與多聯體連接產物的比取決于兩個參數：j和i。j是ＤＮＡ分子的一個末端在同一分子的另一末端附近的有效濃度，j的數值是根據如下一種假設作出的：沉吟液中的ＤＮＡ呈隨機卷曲。這樣，j與ＤＮＡ分子的長度成反比（因為ＤＮＡ越長，某一給定分子的兩末端的越不可能相互作用），因此j對給定長度的ＤＮＡ分子來說是一個常數，與ＤＮＡ深度無關。j＝[3/(3πlb0)]3/2其中l是ＤＮＡ長度，以cm計，b是隨機卷曲的ＤＮＡ區段的長度。b的值以緩沖液的離子強度為轉移，而后者可影響ＤＮＡ的剛度。
i是溶液中所有互補末端的深度的測量值，對于具有自身互補粘端的雙鏈dna而言，i=2NoMx10-3末端/ml這里Ｎo是阿佛伽德羅常數，Ｍ是ＤＮＡ的摩爾濃度（單位：mol/L)。理論上，當j=i時，給定ＤＮＡ分子的一個末端與同一分子的另一末端，以及與不同分子的末端相接觸的可能性相等。因而在這樣的條件下，在反應的初始階段中，環狀分子與多聯體分子的生成速率相等。而當j>i時，有利于重新環化；當i>j，則有利于產生多聯體。圖1.9顯示了ＤＮＡ區段的大小與連接反應混合物中j:i之比分別為0.5、1、2和5時所需ＤＮＡ濃度之間關系（Ｄugaiczyk等，1985）。 現在考慮如下的連接反應混合物：其中除線狀質粒之外，還含有帶匹配末端的外源ＤＮＡ片段。對于一個給定的連接混合物而言，產生單體環狀重組基因組的效率不僅受反應中末端的絕對濃度影響， 而且還受質粒和外源ＤＮＡ末端的相對濃度的影響。當i是j的２－３倍（即末端的絕對濃度足以滿足分子間連接的要求，而又不致引起大量寡聚體分子的形成時）外源ＤＮＡ末端濃度的２倍時，有效重組體的產量可達到最大。這些條什下，連接反應終產物的大約40％都是由單體質粒與外源ＤＮＡ所形成的嵌合體。當連接混合物中線瘃質粒的量恒定（j:i=3）而帶匹配末端的外源ＤＮＡ的量遞增時，這種嵌合體在連接反應之末的理論產量。
涉及帶粘端的線狀磷酸化質粒ＤＮＡ的連接反應應包含：
１）足量的載體ＤＮＡ，以滿足j:i>1和j:i<3。對一個職pUC18一般大小的質粒，這意味著連接反應中應含有載體ＤＮＡ為20-60μg/ml。
２）未端濃度等于或稍高于載體ＤＮＡ的外源ＤＮＡ，如外源ＤＮＡ濃度比載體低得多，在效連接產物的數量會很低，這樣就很難別小部分帶重組抽粒的轉化菌落。這種情況下，可考慮采用一些步驟來減少帶非重組質粒的背景菌落。如用磷酸酶處理線狀質粒ＤＮＡ或發跡克隆策略以便通過定向克隆的方法構建重組質粒。
(二）粘端連接
１）用適當的限制酶消化質粒和外源ＤＮＡ。如有必要，可用凝膠電泳分離片段并（或）用堿性磷酸酶處理質粒ＤＮＡ。通過酚：氯仿抽提和乙沉淀來純化ＤＮＡ，然后用TE(pH7.6)溶液使其濃度為100/ml。
２）按如下所述設立連接反應混合物：
a．將0.1μl載體ＤＮＡ轉移到無菌微量離心管中，加等摩爾量的外源ＤＮＡ。
b．加水至7.5μl，于45℃加溫５分鐘以使重新退炎的粘端解鏈，將混合物冷卻到０℃。
c．加入：10xT4噬菌體ＤＮＡ連接酶緩沖液 １μl
Ｔ４噬菌體ＮＤＡ連接酶 0.1Weiss單位
５mmol/L ATP 1μl
于16℃溫育１－４小時
10xT4噬菌體ＤＮＡ連接酶緩沖液
200mmol/L同Tris.Cl(pH7.6)
50mmol/K MgCl2
50mmol/L二硫蘇糖醇
500μg/ml牛血清白蛋白（組分Ｖ.Sigma產品）（可用可不用）
該緩訓液應分裝成小份，貯存于－20℃。
另外，再設立兩個對照反應，其中含有（１）只有質粒載體；（２）只有外源ＤＮＡ片段。如果外源ＤＮＡ量不足，每個連接反應可用50-100ng質粒ＤＮＡ，并盡可能多加外源ＤＮＡ，同時保持連接反應體積不超過10μl。可用至少３種不同方法來測定Ｔ４噬菌體ＤＮＡ連接酶的活性。大多數制造廠商（除New England Biolabs公司外）現在都用Weiss等，１1968)對該酶進行標化。１個Weiss單位是指在37℃下20分釧內催化１mmol32P從焦磷酸根置換到[γ,β-32P]ATP所需酶時，１個Weiss單位相當于0.2個用外切核酸酶耐受試驗來定義的單位（Modrich和Lehman,1970)或者60個粘端單位（如Ｎew England Biolabs公司所定義）。因此，0.015Ｗeiss單位的Ｔ４噬菌體ＤＮＡ連接酶在16℃下30分鐘內可使50％的λ噬菌體HindⅢ片段（5μg）得以連接。在本書中，Ｔ４噬菌體ＤＮＡ連接酶一律用Weiss單位表示。\par 目前提供的Ｔ４噬菌體ＤＮＡ連接酶均為濃溶液（1-5單位/μl），可用20mmol/L Tris.Cl(pH7.6)、60mmol/L KCl、5mmol/L二硫蘇糖醇、500μg/ml牛血清白蛋白、50％甘稀釋成100單位/ml的濃度置存。處于這種濃度并在這種緩沖液中的Ｔ４噬體ＤＮＡ連接酶于-20℃保存３個月可保持穩定。
３）每個樣品各取１－２μl轉化大腸桿菌感受態細胞。
（三）平端ＤＮＡ連接
Ｔ４噬菌體ＤＮＡ連接酶不同于大腸桿菌ＤＮＡ連接酶，它可以催化平端ＤＮＡ片段的連接（Sgaramella和Khorana,1972;Sgaramella和Ehrlich,1978），由于ＤＮＡ很容易成為平端，所以這是一個極為有用的酶學物性。有了這樣的物性，才能使任何ＤＮＡ分子彼此相連。然而，相對而言，平端連接是低效反應，它要求以下４個條件：
１）低濃度（0.5mmol/L）的ATP(Ferretti和Sgaranekka,1981）。
２）不存在亞精胺一類的多胺。
３）極高濃度的連接酶（50Weiss單位．ml）。
４）高濃度的平端。
１．凝聚劑
在反應混合物中加入一些可促進大分子群聚作用并可導致ＤＮＡ分子凝聚成集體的物質，如聚乙二醇（Pheiffer和Zimmerman,1983;Zimmerman和Pheiffer,1983;ZimmermanT Ｈarrison,1985)或氯化六氨全高鈷（Rusche和Howard-Flanders,1985）,可以使如何取得適當濃度的平端ＤＮＡ的總是迎刃而解。在連接反應中，這些物質具有兩作用：
１）它們可使平端ＤＮＡ的連接速率加大１－３個數量級，因此可使連接反應在酶ＤＮＡ濃度不高的條件下進行。
２）它們可以改變連接產物的分布，分子內連接受到抑制，所形成的連接產物一律是分子間連接的產物。這樣，即使在有利于自身環化（j:i=10）的ＤＮＡ濃度下，所有的ＤＮＡ產物也將是線狀多聚體。\par 在設立含凝聚劑的連接反應時，下列資料可供參考。
（１）聚乙二醇（PEG8000）
１）用去離子水配制的ＰＥＧ8000貯存液（40％）分裝成小份，冰凍保存，但加入連接反應混合物之前應將其融化并使其達到室溫。在含15％PEG 8000的連接反應混合物中，對連接反刺激效應最為顯著。除PEG 800和Ｔ４噬菌體ＤＮＡ連接酶以外，其他所有連接混合物的組分應于０℃混合，然后加適當體積的PEG 8000（處于室溫），混勻，加酶后于20℃進行溫育。
２）連接混合物中含0.5mmol/L ATP和5mmol/L MgCl2時對連接反應的刺激效應最為顯著，甚至ATP濃度略有增加或ＭgCl2濃度略有降低，都會嚴重降低刺激的強度（Pheiffer和Zimmerman,1983）。
３）濃度為15％的PEG 8000可刺激帶粘端的ＤＮＡ分子的連接效率提高至原來的10-100倍，反應的主產物是串聯的多聯體。
４）PEG 8000可刺激短至８個核苷酸的合成寡聚物的平端連接，在這一方面，它與氯化六氨合高鈷有所不同。
（２）氯化六氨合高鈷
１）氯化六氨合高鈷可用水配成10mmol/L貯存液貯存于-20℃，它對連接反應的刺激具有高度的濃度信賴性。當連接反應混合物中鹽深度為1.0-1.5μmol/L時，其刺激作用最大。氯化六氨合高鈷可使平端連接的效率大約提高到原來的50W部，但只能使端連接的效率提高到原來的５倍（Rusche和Howard-Flanders,1985）。
２）在單價陽離子（30mmol/L KCl）存在下，它對平端連接仍有一定的刺激作用，但此時連接產物的分布有所改變。連接產物不再是清一色的分子間連接產物，相反，環狀ＤＮＡ將點盡優勢。
３）與ＰＥＧ 8000不同，氯化六氨合高鈷不能顯著提高合成寡核苷酸的連接速率。
（四）質粒載體中的快速克隆
質粒克隆中最慢的步驟是所需的外源ＤＮＡ片段和相應質粒ＤＮＡ區段的電泳純化，下面的操作方案[由S.Michaelis(個人通訊）根據Struhl(1985)的方法修訂而成]是從純化的凝膠中回收瓊脂糖塊，熔化后直接進行質粒和外源ＤＮＡ的連接。這一方法尋平端連接和粘端連接都同樣奏效，但需大量的連接酶，而且效率要比標準操作方案約低一個數量級。
１）用適當的限制酶消化外源ＤＮＡ，其量應足以產生約0.2μg的靶片段。反應體積應為20μl或更小。在另一管中，用相應的限制酶消化約0.5μg載體ＤＮＡ，總反應體積為20μl或更小。如載體ＤＮＡ帶相同的端，應用磷酸處理如下：用限制酶消化完全后，加2.5μl 100mmol/L Tris.Cl(pH8.3)、10mmol/L ZnCl2,加0.25單位牛小腸堿性磷酸酶，于37℃溫育30分鐘。
２）通過瓊脂糖凝膠電泳分離目標片段。務必用低熔點瓊脂糖灌制凝膠，務必用含溴化乙錠（0.5μg/ml）的１xTAE作為電泳緩沖液而不是常規的0.5xTBE來配制凝膠并進行電泳。
３）在長波長紫外照射下檢查凝膠，根據目標條帶的相對熒光強度估計所含ＤＮＡ的量（見附錄Ｅ）。用刀片切出目標條帶，盡可能少瓊脂糖的體積（通常40-50μl)。將切下凝膠片分別放入作好標記的各個微量離心管中。
４）于70℃加熱10-15分釧，使瓊脂糖熔化。
５）合并熔化的小份凝膠并放到加溫至37℃的中一管中，共終體積應不超過10μl,外源ＤＮＡ與質粒載體的摩爾比應接近２：１。
用另外兩個管設立兩個對照連反應，一個只含質粒載體，另一個只含外源ＤＮＡ片段。
６）將３個管于37℃溫育5-10分鐘，然后每管加10μl用冰預次的２xT４噬體ＤＮＡ連接酶混合物，在瓊脂糖凝固前，充他混勻各管內容物，于16℃溫育12-16小時。
２xT４噬菌體ＤＮＡ連接酶混合物可制備如下：
1mol/L Tris.Cl(pH7.6) 1.0μl
100mmol/L氯化鎂 1.0μl
200mmol/L三硫蘇糖醇 1.0μl
10mmol/L ATP 1.0μl
水 5.5μl
Ｔ４噬菌體ＤＮＡ連接酶 １Ｗeiss單位
混勻后放置于冰浴上。
７）連接反應行將結束時，取出貯存于-70的３管各200μl的凍存大腸桿菌感受態細胞
８）于70℃中熱10-15分鐘重新溶化連接混合物中的瓊脂糖。
９）立即從每管連接混全物中取出５μl加到200μl大腸桿菌感受態細胞中，小心搖晃，快速地混勻內容物。從剩下每管連接混合物中分別再取５μl重復以上步驟，將轉化混合物在冰浴上放置30分鐘。
10）完成轉化方案的其余各步。