實驗方法原理
Lowry 法又稱為 Folin-酚試劑法。首先在堿性溶液中形成銅-蛋白復合物,然后這一復合物還原磷鉬酸-磷鎢酸試劑
(Folin-酚上級),產生鉬藍和鎢藍復合物的深藍色,這種深藍色 的復合物在745~750 nm
處有最大的吸收峰,顏色的深淺(吸收值)與蛋白質濃度成正比,可根據 750nm 的光吸收值大小計算蛋白質的含量。
實驗材料 待測蛋白質樣品
試劑、試劑盒 五水硫酸銅檸檬酸碳酸鈉NaOHFolin-酚試劑
儀器、耗材 分光光度計比色杯移液管槍頭和加樣槍試管(3~5 ml)試管架震蕩器
實驗步驟
1. 溶液
1.1 溶液 A,100 ml
0.5 g CUSO4·5H2O
1 g Na3C6H5O7(·2H2O)
加雙蒸水至 100 ml, 溶液可長期保存于室溫。
1.2 溶液 B,1L
20 g Na2CO3
4 g NaOH
加雙蒸水至 1 L, 溶液可長期保存于室溫。
1.3 溶液 C,51 ml
Folin 溶液A
50 ml 溶液B
1.4 溶液 D,20 ml
10 ml Folin-酚試劑
10 ml 雙蒸水
2. 檢測
2.1 用雙蒸水稀釋樣品至 0.5 ml;
2.2 加 2.5 ml 溶液 C;
2.3 混勻在室溫下放置 5~10 min;
2.4 加 0.25 ml 溶液 D, 混勻;
2.5 20~30 min 后,在分光光度計上測 A750 值。
3. 從干擾物質中純化蛋白質樣品的附加步驟
脫氧膽酸-三氯醋酸(DOC-TCA)沉淀法。此法可在測定蛋白質的溶液濃度低于 1 ug/ml 情況下使用。
所需試劑:0.15 % (w/V)DOC:72 % TCA
3.1 于 1 ml 蛋白質樣品中加入 0.1ml 0.15 % DOC;
3.2 震蕩后在室溫放置 10 min;
3.3 加入 0.1 ml 72 % TCA, 搖勻后,1000~3000×g 離心 5~30 min。如使用固定角轉頭,以及低溫或大體積則需較長時間離心;
3.4 傾斜,吸棄上清液;
3.5 直接用溶液 C 溶解沉淀。
注意事項
1. 在加入試劑 20~30 min 后呈色達到飽和,此后每小時顏色信號減弱 1 %。
2. 許多干擾物質降低顏色反應,而去垢劑引起顏色輕微升高。
3. 高濃度鹽可引起沉淀。
4. 氯仿抽提可去除溶液中的脂質,在 K+ 或 Triton X-100 存在時可通過離心去除混濁物。
5. 去垢劑,蔗糖和 EDTA 的干擾可通過在 Lowry 試劑中加入 SDS 來消除。
6. —般情況下,蛋白質-染料復合物的消光系數 ≤ 1.2。