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  • 發布時間:2020-08-17 14:39 原文鏈接: Lowry檢測法測定蛋白質濃度實驗

    實驗方法原理 
    Lowry 法又稱為 Folin-酚試劑法。首先在堿性溶液中形成銅-蛋白復合物,然后這一復合物還原磷鉬酸-磷鎢酸試劑 (Folin-酚上級),產生鉬藍和鎢藍復合物的深藍色,這種深藍色 的復合物在745~750 nm 處有最大的吸收峰,顏色的深淺(吸收值)與蛋白質濃度成正比,可根據 750nm 的光吸收值大小計算蛋白質的含量。
    實驗材料 待測蛋白質樣品
    試劑、試劑盒 五水硫酸銅檸檬酸碳酸鈉NaOHFolin-酚試劑
    儀器、耗材 分光光度計比色杯移液管槍頭和加樣槍試管(3~5 ml)試管架震蕩器
    實驗步驟 
    1. 溶液

    1.1 溶液 A,100 ml
    0.5 g CUSO4·5H2O
    1 g Na3C6H5O7(·2H2O)
    加雙蒸水至 100 ml, 溶液可長期保存于室溫。

    1.2 溶液 B,1L
    20 g Na2CO3
    4 g NaOH
    加雙蒸水至 1 L, 溶液可長期保存于室溫。

    1.3 溶液 C,51 ml
    Folin 溶液A
    50 ml 溶液B

    1.4 溶液 D,20 ml
    10 ml Folin-酚試劑
    10 ml 雙蒸水

    2. 檢測

    2.1 用雙蒸水稀釋樣品至 0.5 ml;

    2.2 加 2.5 ml 溶液 C;

    2.3 混勻在室溫下放置 5~10 min;

    2.4 加 0.25 ml 溶液 D, 混勻;

    2.5 20~30 min 后,在分光光度計上測 A750 值。

    3. 從干擾物質中純化蛋白質樣品的附加步驟
    脫氧膽酸-三氯醋酸(DOC-TCA)沉淀法。此法可在測定蛋白質的溶液濃度低于 1 ug/ml 情況下使用。
    所需試劑:0.15 % (w/V)DOC:72 % TCA

    3.1 于 1 ml 蛋白質樣品中加入 0.1ml 0.15 % DOC;

    3.2 震蕩后在室溫放置 10 min;

    3.3 加入 0.1 ml 72 % TCA, 搖勻后,1000~3000×g 離心 5~30 min。如使用固定角轉頭,以及低溫或大體積則需較長時間離心;

    3.4 傾斜,吸棄上清液;

    3.5 直接用溶液 C 溶解沉淀。

    注意事項 
    1. 在加入試劑 20~30 min 后呈色達到飽和,此后每小時顏色信號減弱 1 %。

    2. 許多干擾物質降低顏色反應,而去垢劑引起顏色輕微升高。

    3. 高濃度鹽可引起沉淀。

    4. 氯仿抽提可去除溶液中的脂質,在 K+ 或 Triton X-100 存在時可通過離心去除混濁物。

    5. 去垢劑,蔗糖和 EDTA 的干擾可通過在 Lowry 試劑中加入 SDS 來消除。

    6. —般情況下,蛋白質-染料復合物的消光系數 ≤ 1.2。


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