MIDASTM確證Biomarker（二）

鑒定過程共進行兩次實驗，約30多種蛋白質被鑒定出來，已鑒定的蛋白質如表1所示，其中紅色標注的蛋白又通過MIDASTM確認。兩次實驗結果相比較，重疊率低于75%。許多在第一次實驗中被鑒定但可信度較低的蛋白質，第二次實驗中并未產生更多的MS/MS圖譜，沒被再次鑒定出來，增加了鑒定與驗證確認的難度。例如：在第一次實驗中被鑒定的蛋白質RBM17 （RNA binding motif protein 17）（表1，#24），其鑒定結果僅被一個高分值的多肽（LLQSQLQVK）所支持，并經人工分析后鑒定出來（如圖4所示）。但在第二次實驗中，該蛋白質并沒有被再次鑒定。此例說明需要更可靠的方法來驗證并確認它在樣本中是否真實存在。此應用實例中，選擇表1中紅色標示的4個蛋白質進行MIDASTM驗證，確認其是否真實存在于樣本中。

圖4.  被鑒定的蛋白質RBM17，其鑒定結果僅被第一次LC-MS/MS實驗的一個高分值的多肽所支持。

實驗方法

樣品制備

樣品根據以前的方法制備[6]。簡要的說，mRNA剪拼體復合物通過親和純化，而后通過甘油梯度離心后，樣本被分離成亞復合物。這些亞復合物經過SDS-PAGE分離后，用考馬斯亮藍染色。整個樣本電泳泳道用胰蛋白酶進行?位酶解后，萃取并凍干酶切產物肽段。

高效液相色譜分離

酶切產物肽段用納升級液相色譜（LC Packing 整機系統，Dionex公司）分離。經過C18預柱脫鹽后，通過C18分析柱（75mm×15cm, PepMap, Dionex）分離。分離條件：5%~40%乙腈，0.1%甲酸，流速200nl/min，60min梯度洗脫。

MIDASTM工作流程設計器

每一個需要被進一步確認的蛋白質，其胰蛋白酶酶切后的肽段作為母離子被Q1選擇出來，經過Q2碎裂后，在Q3中高特異性的檢測其碎片離子。只有當上述三個四級桿的掃描條件同時滿足時，信號才被記錄。因此，上述MRM掃描模式是LC-MS/MS在復雜體系樣本中最靈敏且選擇性最高的檢測技術。由于每個MRM傳輸只需5~50ms的駐留時間（Dwell time），所以一次運行中可以同時檢測多達300個分析物，大量不同的多肽可以同時被掃描檢測（如圖5所示）。

圖5.  MRM引導的MIDASTM工作流程圖，所有預期的胰酶酶切蛋白質所產生的多肽通過MRM掃描模式監測，驗證其是否存在，一旦信號被檢測到，儀器會立刻自動切換到高靈敏度MS/MS采集，從而確認蛋白質的真實性。

胰蛋白酶酶切后的多肽與它們的碎片離子所構成的母-子離子對，可以通過MIDASTM工作流程設計器軟件計算出來。根據用戶輸入的蛋白質序列，此軟件可自動計算并構建MRM掃描模式所需的母/子離子對，且不需要合成多肽或蛋白質參照物來設計MRM掃描條件。

質譜配合MIDASTM方法檢測

使用NanoSpray離子源配合4000 QTRAP

LC-MS/MS進行MIDASTM檢測。

數據庫檢索參數

驗證過程中使用MASCOT 1.9（Matrixscience Ltd.）數據庫檢索引擎，檢索NCBInr蛋白質數據庫。簡要參數設置如下：MS tolerance 0.2，MS/MS tolerance 0.3，Missed cleavages 0，No variable modefications。

結果

目標蛋白質驗證與確認結果

此實驗中所選擇的4個蛋白質，MIDASTM工作流程設計器計算得出83個母/子離子對用于分析。此83個母/子離子對在實際LC-MS/MS實驗中不斷地被檢測到（如圖6上圖所示）。實驗中，一旦MRM掃描出現信號，指示有多肽母離子從色譜柱中洗脫出來，質譜儀立即切換至MS/MS掃描模式（每個肽段母離子，最多采集3次MS/MS圖譜數據），采集到的數據經數據庫檢索后，用于再次確認洗脫下來的多肽是否是來自預期的蛋白質。

圖6.  MIDASTM工作流程確認實驗，通過83個母/子離子的提取離子質量色譜圖（XIC）確認4個蛋白質（上圖），得到雙電荷m/z894.4的MS/MS譜圖的碎片離子確認RBM17的多肽序列為CVIFEIPGAPDDEAVR（下圖）。

由于線性離子阱具有極高的靈敏度，即使在MRM掃描中非常低的離子信號，在線性離子阱MS/MS掃描中也可以獲得高質量的MS/MS圖譜來驗證確認蛋白質。如圖6下圖所示，即使是豐度很低的肽段（CVIFEIPGAPDDEAVR），它的MS/MS圖譜質量仍然很好，可以清晰地看到從脯氨酸氨基端碎裂而形成的y10離子。

數據庫檢索結果

通過MIDASTM方法，樣本中被選擇進行驗證與確認工作的4個低豐度蛋白質都以高分值被驗證，每個被確認的蛋白質MASCOT分值都高于100（圖7上圖所示）。蛋白質RBM17，被5個高分值的多肽所確認。其氨基酸覆蓋率達到13.7%（圖7）。

圖7.  在MASCO檢索結果中4個低豐度蛋白質都以高分值被驗證（上圖）。此外，蛋白質RBM17被5個分值都大于15的多肽序列所確認（下圖）。

由于MIDASTM工作流程的高選擇性與靈敏度，即便是在常規Nano-LC-MS/MS實驗中模糊的鑒定結果，都可以準確地被驗證其在樣本中是否真實存在，避免了假陽性的結果，如圖8所示。

圖8.  4種目標蛋白質確認結果總結，藍色和紅色柱狀圖為標準LC-MS/MS 實驗，綠色為MIDASTM工作流程確認結果。

結論

由于MRM采集方式的高選擇性與靈敏度，非常適合在動態變化且體系復雜的樣本中驗證低豐度蛋白質的存在。
在此項實驗中，結合4000 QTRAP線性離子阱串聯三級四極桿質譜系統，基于MRM的MIDASTM技術方案成功驗證了低豐度的4個蛋白質確實存在于人體mRNA剪拼體復合物中。與常規Nano-LC-MS/MS質譜儀蛋白質鑒定實驗相比，由MRM引導的線性離子阱MS/MS掃描顯著提高了氨基酸覆蓋率，增強了可信度與準確性（圖8）。

MIDASTM技術方案充分利用了QTRAP這類（線性離子阱串聯三級四極桿）質譜系統的功能特點，既通過其三級四極桿的MRM掃描模式驗證存在性，又利用其線性離子阱MS/MS掃描靈敏度高的特點確認真實性。因此，MIDASTM技術方法將在生物標志物的驗證與確認領域發揮越來越重要的作用。

【參考文獻】

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2. Panchaud A, Kussmann M and Affolter M, Proteomics 5, 3836-46 （2005）.

3. Chamrad DC, koerting G, Stühler K, Meyer HE, Klose J and Blüggel M, Proteomics 4, 619-28 （2004）.

4. Unwin RD, Griffiths JR, Leverentz MK, Grallert A, Hagan IM and Whetton AD, Mol. Cell. Proteomics 4, 1134-1144 （2005）.

5. Cox DM, Zhong F, Du M, Duchoslav E, Sakuma T and McDermott JC, J. Biomol. Tech. 16,83-90 （2005）.

6. Hartmuth K, Urlaub H, Vornlocher HP, Will CL, Gentzel M, Wilm M and Lührmann R, PNAS 99, 16719-24 （2000）