PCR 簡單來說就是在合適條件下,熱變性-復性-延伸過程的不斷重復。整個過程有點像是織圍巾,但也不完全是這樣。織圍巾(PCR)所必須的原材料有這樣幾個元素織樣(模板)、起針(引物對)、毛線(dNTP)和針(Taq酶以及緩沖體系)。
首先要將織樣拆解開(通過95℃高溫,將DNA雙鏈拉鏈狀解鏈),然后將實現織好的起針配合在織樣上(通過退火將合成的引物結合在單鏈的模板上),按照織樣(模板),沿著起針(引物)用毛衣針(Taq酶)將毛線(dNTP)一針針連接上去(72℃下延伸擴增)。
通過對所有織樣(包括原先的模板及新形成的模板)的拆解(解鏈)及新的起針(引物)搭配(結合)、編織(Taq酶擴增)這樣循環n次后,圍巾的數量就以2的n次方(產物量就以2的n次方)增多了。
PCR試驗最早是以Klenow片段進行擴增的,由于這種酶高溫會變性,所以最早的PCR實驗員是很苦逼的,每個循環都需要開蓋、加酶、換水浴鍋,這樣35個循環……后來發現了Taq酶之后,事情就簡單了,由于Taq酶可以應付高溫環境,于是就產生了新的PCR儀,也就是現在的定時變溫金屬浴。還有別忘了加熱蓋,沒有熱蓋的話,管內高溫會導致液體全都蒸發到管蓋上,就沒法擴增了。
PCR的技巧,關鍵的PCR技巧在于引物的設計,這個我們以后還可以深入解釋。但有的時候,如果要克隆固定片段,引物設計位置是定死的,只能微調,那什么引物設計軟件都是白搭。
其次的關鍵是鎂離子濃度,鎂離子是Taq酶的激活劑,濃度過低會導致PCR產量下降,濃度過高則會產生非特異性擴增。