PCR異常擴增曲線分析攻略（一）

發布時間：2021-06-23 15:45 原文鏈接： PCR異常擴增曲線分析攻略（一）

近幾年，從科學研究到臨床檢測，從“非洲豬瘟”檢測到“新冠病毒”檢測，熒光定量PCR儀器已成為分子生物學研究的常規設備。檢測方法的迅速發展，檢測任務的緊急也對檢測人員提出了更高的要求，需要他們具備熟練判斷數據結果的能力。對于熒光定量PCR的結果的判斷，最直觀的判斷就是看擴增曲線是否正常。很多老師在平時實驗中會遇到異常擴增曲線的困擾，比如打折的擴增曲線、復孔間重復性不好、陰性樣本擴增曲線抬升等。面對異常的擴增曲線，大家也不用擔心，接下來我們會結合幾個實例，帶著大家一起來看一下比較常見的異常擴增曲線的分析攻略。

1 確認軟件設置是否正確

對照試劑盒說明書，檢查時間、溫度、循環數、熒光采集等是否設置正確。有一個比較容易忽略的設置問題是，需要看下所選用的試劑中是否含有ROX來作為參比熒光染料。Applied Biosystems^TM系列熒光定量PCR 儀器可以用ROX來作為參比熒光染料，用以校正儀器系統以外的物理誤差，比如均一化校正由于移液誤差或者蒸發導至的批內體積誤差等。

目前市面上有的的熒光定量PCR預混液是不含有ROX的，當用此類試劑的時候，應該將ROX參比功能關閉，否則可能會出現圖一左圖所示的，擴增曲線異常的現象。遇到這種問題，可以在Plate Setup設置中找到Passive Reference，把ROX改為None，重新分析一下，結果就變正常了（圖一右圖）。Applied Biosystems^TM系列熒光定量PCR 儀器默認是對所有熒光通道及所有樣品孔進行熒光采集，用戶不用擔心數據丟失，實驗完成后，還可以對設置錯誤的反應孔的熒光通道、樣品名稱等進行更改。

圖一：使用不含ROX試劑，忘記更改Passive Reference結果圖及更改后的結果圖

還有一些結果，多組分圖擴增曲線沒有抬升，是很明顯的陰性樣本，但是擴增圖譜的擴增曲線抬升了，這樣就會與閾值線相交，反而有了CT值。這是由于軟件在進行基線自動扣除的時候出現錯誤，引起了擴增曲線抬升（圖二）。出現這種情況可以采取手動調整基線的方法，重新定義基線即可正常，即將基線起點改為熒光信號穩定的循環數（一般是3），基線終點要改成擴增曲線起峰的前一個循環數（比如起峰是在第25個循環，那基線的終點就是24）。引起這樣的原因是由于選用的耗材、試劑或者操作的原因導至背景熒光信號有所波動，從而造成反應孔的自動基線扣除錯誤。