PCR電泳圖怎么分析？

PCR擴增后一般進行瓊脂糖凝膠電泳分析，電泳后一般有以下幾種條帶：

　　1、引物帶。引物濃度過高或是擴增效率不是特別高時都會有，一般不呈現為細帶，為發散狀；如果目的擴增產物帶和引物帶都很亮，可以考慮適當降低引物量。

　　2、引物二聚體帶。比引物跑得慢一點，條帶清晰，但如果擴增產物小于100bp時，產物與引物二聚體就不好分別了，建議采用DNA聚丙烯酰胺電泳（不是蛋白質的SDS聚丙烯酰胺電泳）；如果引物二聚體在優化復性溫度后仍然嚴重影響目的產物的擴增，優先考慮更換引物設計（因為引物合成的成本比反復優化條件的成本低）

　　3、目的擴增產物帶。其大小與設計大小相同，條帶清晰。

　　4、非特異擴增產物帶。其大小與設計大小不相同，條帶清晰。一般考慮通過提高復性溫度來減少或消除（也可用溫度梯度功能來尋找zui佳的復性溫度，東勝龍811型PCR儀就有此功能）。如果其片段大小比目的片段大較多，可以通過減少延伸時間來減少或消除（即不給它足夠的延伸時間）。還有一種非特異擴增產物帶是來自于逆轉錄PCR實驗時的基因組DNA的污染，如果目的擴增產物中有內含子，擴增產物很可能大于目的基因。這種條帶通過優化復性溫度是不能消除的，可以在逆轉錄前用無RNA酶的DNA酶進行樣本處理。

　　5、模板DNA帶。模板濃度過高時可能出現。如果是基因組DNA為模板，條帶可能會很亂且較大。一般進行PCR擴增時，模板濃度都不要太大，否則會產生一些比目的基因長一點的雜質DNA（可能不成條帶，也看不到），這是由PCR擴增原理造成的。

　　PCR反應的關鍵環節有①模板核酸的制備，②引物的質量與特異性，③酶的質量及，④PCR循環條件。當結果分析出現假陰性，不出現擴增條帶時，尋找原因進行分析研究。

　　 模板：①模板中含有雜蛋白質，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。⑤模板核酸變性不徹底。在酶和引物質量好時，不出現擴增帶，極有可能是標本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩定的消化處理液，其程序亦應固定不宜隨意更改。

　　 酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導致假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。

　　 引物：引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：①選定一個好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。③引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導致引物變質降解失效。④引物設計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。

　　反應體積的改變：通常進行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul。或100ul，應用多大體積進行PCR擴增，是根據科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20ul 后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。

　　 物理原因：變性對PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現假陰性；退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。

　　 靶序列變異：如靶序列發生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。