PCR擴増實驗

dNTP混合物基因特異的正向引物基因特異的反向引物單鏈cDNATaqDNA聚合酶RT-PCR緩沖液

PCR儀PCR管

一、材料

1. 緩沖液、溶液和試劑

去除 RNA 酶的雙蒸水

10XRT-PCR 緩沖液（100 mmol/LTris-HCl、pH8.3,500 mmol/LKC1，15 mmol/LMgCl₂)

2. 酶和酶緩沖液

TaqDNA 聚合酶（5U/ul)

3. 核酸和寡核苷酸

dNTP 混合物（10 mmol/L，包含所有四種 dNTP)

基因特異的正向引物（5umol/L)

基因特異的反向引物（5umol/L)

單鏈 cDNA(見第一部分）

4. 放射性復合物

[a^-32P]dCTP(10uCi/ul)(lCi=37 GBq)

5. 實驗器材

薄壁的 PCR 管

6. 專用儀器

可編程的 PCR 儀

二、方法

1. 準備 PCR 反應混合物。

由第一部分制得的 cDNA                      11ul

10XRT-PCR 緩沖液                              55ul

10 mmol/LdNTP 混合物                        44ul

5umol/L 基因特異的正向引物               22ul

5umol/L 基因特異的反向引物               22ul

5U/ulTaqDNA 聚合酶                            2.75ul

去除 RNA 酶的雙蒸水                           387.75ul

[a^-32P]dCTP(10uCi/ul)                         5.5ul

2. 平均 50ulPCR 反應混合物分別放入 10 個薄壁 PCR 管中。

3. 帶有熱蓋的適當的 PCR 儀（如：GeneAmpPCRSystem9700，AppliedBioSystems)

上運行 PCR。PCR 擴增的循環參數如下。

94°C30s

退火溫度 30s

72°C30s

35 個循環

4. 每次奇數脈沖循環后放在冰上取樣，由第 15 個循環起始，到第 35 個循環終止。

5. 變性聚丙烯酰胺凝肢（6% 丙烯酰胺/8mol/L 尿素）上分析樣品。每個樣品上樣

10ul。濾紙上干燥凝肢，用 Phosphorlmager 或 X 射線片和 densitometer 對產物定量，也可以將產物條帶從凝膠上切下，通過閃爍記數儀定量。

6. 信號的對數（y 軸）對應循環數（x 軸）作圖。選擇處于線性范圍中心的循環數在后

續實驗中使用。