RTPCR擴增目的基因cDNA

實驗概要

學習從細胞或組織的RNA中用逆轉錄PCR擴增目的基因的技術及操作。

實驗原理

普通PCR方法可以以DNA為模板擴增基因，但真核生物的基因組中通常分為可轉為mRNA的外顯子和不轉錄的成mRNA的內含子，所以從染色體DNA用PCR方法擴增出的基因是內含子和外顯子相間排列的DNA分子，不能用于基因工程的直接表達。如果用人工的方法把內含子去除，是極其煩瑣費力的事。逆轉錄PCR利用逆轉錄病毒依賴于RNA的DNA逆轉錄合成酶，在反義引物或oligo（d T）的引導下合成mRNA互補的DNA（complemental DNA），再按普通的PCR的方法用兩條引物以cDNA為模板，擴增出不含內含子的可編碼完整蛋白的基因。這一DNA的5，和3，端經改造可直接用于基因工程的表達，因此逆轉錄PCR成為了目前獲取目的基因的一條重要途徑。

主要試劑

1、RNA模板

2、cDNA引物

3、反轉錄緩沖液

4、dNTP

5、AMV反轉錄酶

6、RNA抑制劑（RNasin）

7、Taq酶

8、10×PCR緩沖溶液

9、引物（P1、P2）

主要設備

1、PCR擴增儀

2、電泳儀

3、臺式離心機

4、恒溫水浴

5、紫外分析儀

6、微量移液器

實驗步驟

一、RNA的反轉錄

1、在小管中依次加入

5 ul RNA 

6 ul DEPC H2O 

混合后,65℃×5 min(破壞二級結構). 

2、置于冰浴5 min.

3、在管中依次加入: (反應體系為20 ul)  

RT buffer ( 5×)4 ul 

RNasin0.5 ul 

dNTP ( 10mM)2 ul

Oligo T17A（G／C） （50-100 uM） 1 ul

AMV反轉錄酶1 ul 

置于 42℃× 1 h。

4、70℃× 5 min（使酶失活，可省略）。

5、加入100ul ddH2O (從總RNA開始制備)或1000 ulddH2O（從mRNA開始制備）。

6、置于-20℃保存備用.
 

二、PCR擴增DNA

在滅菌的0.5ml PCR管中，依次加入

20μl              cDNA

10μl              10×PCR buffer

5μl               dNTP

2μl               RT引物I

2μl               RT引物II

1μl              Taq DNA聚合酶

加ddH2O 補足50μl ，混勻。

PCR程序：

                             94 ℃        3 min        

                             95 ℃        30 s

         35 cycles:     55 ℃        60 s

                             72 ℃        90 s                

                             72 ℃        10 min
 

三、PCR產物的鑒定

取20ul PCR產物進行1.2%瓊脂糖電泳分析。