提取組織或細胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用0ligo (dT)或隨機引物利用逆轉錄酶反轉錄成cDNA。再以cDNA為模板進行PCR擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達。RT-PCR 使測的靈敏性提高了幾個數量級，使- - 些極為微量RNA樣品分析成為可能。該技術主要用于:分析基因的轉錄產物、獲取目的基因、合成cDNA探針、構建RNA高效轉錄系統。
(一)反轉錄酶的選擇
1.Moloney鼠白血病病毒(MMLV)反轉錄酶:有強的聚合酶活性，RNA酶H活性相對較弱。最適作用溫度為37°C。
2.禽成髓細胞瘤病毒(AMV)反轉錄酶:有強的聚合酶活性和RNA酶H活性。最適作用溫度為42"C。
3. Thermus thermophi lus、Thermus flavus 等嗜熱微生物的熱穩定性反轉錄酶:在Mn2存在下，允許高溫反轉錄RNA，以消除RNA模板的二級結構。
4. MMLV 反轉錄酶的RNase H- 突變體:商品名為SuperScript和SuperScript II。此種酶較其它酶能多將更大部分的RNA轉換成cDNA，這一特性允許從含 二級結構的、低溫反轉錄很困難的m模板合成較長cDNA。
(二)合成cDNA引物的選擇
1.隨機六聚體引物:當特定mRNA由于含有使反轉錄酶終止的序列而難于拷貝其全長序列時，可采用隨機六聚體引物這-不特異的引物來拷貝全長mRNA。用此種方法時，體系中所有RNA分子全部充當了cDNA 第一鏈模板，PCR引物在擴增過程中賦予所需要的特異性。通常用此引物合成的cDNA中96%來源于rRNA。
2. 0ligo(dT): 是一種對mRNA特異的方法。因絕大多數真核細胞mRNA具有3’端Poly(A )尾，此引物與其配對，僅mRNA被轉錄。由于Poly(A )RNA僅占總RNA的1-4%，故此種引物合成的cDNA比隨機六聚體作為引物和得到的cDNA在數量
3.特異性引物:最特異的引發方法是用含目標RNA的互補序列的寡核苷酸作為引物，若PCR反應用二種特異性引物，第一條鏈的合成可由與mRNA 3’端最靠近的配對引物起始。用此類引物僅產生所需要的cDNA，導致更為特異的PCR擴增。生物科研www. biom. cn
二、實驗耗材與試劑
1. RNA 提取”target="_ blank" >RNA 取試劑