SPERRLC法測定奶制品中的三聚氰胺

圖1.  濃度與峰面積的回歸曲線。

本方法采用SampliQSCX固相萃取小柱、亞二微米的ZORBAXSBC8RRHT反相色譜柱、離子對色譜法，快速分析了奶粉與液態奶中的三聚氰胺。分析方法采用反相色譜方法，色譜柱來源豐富，儀器配置簡單，方法簡便易行，可作為常規三聚氰胺篩查方法使用。分析既可在普通HPLC上進行，亦可在高分離度快速液相色譜（RRLC）上進行。

奶粉、液態奶試樣用三氯乙酸溶液-乙腈提取，經SampliQ-SCX陽離子交換固相萃取柱凈化后，用高效液相色譜－離子對色譜法測定，外標法定量，可采用液相色譜-質譜/質譜或氣相色譜-質譜或氣相色譜-質譜/質譜確證。

采用ZORBAXSBC8和RX-C8反相色譜柱，以10mmol/L檸檬酸和10mmol/L辛烷磺酸鈉溶液（pH=3.0）-乙腈（92:8）為流動相，檢測波長240nm，流速1.5ml/min，柱溫30℃。

實驗及方法

儀器與材料

本實驗使用安捷倫1200RRLC－DAD高效液相色譜系統（配置在線真空脫氣機、二元泵、高性能自動進樣器、柱溫箱、紫外檢測器）進行檢測；電子天平為METTLER TOLEDO公司的AL104；pH計為METTLER TOLEDO公司的DELTA320；分析天平：感量為0.0001g和0.01g。離心機：轉速不低于4000r/min；固相萃取裝置（包括試管架、收集瓶、真空與流速調節閥等附件）；氮氣吹干儀；陽離子交換固相萃取柱：SampliQ，150mg/6ml或60mg/3ml；定性濾紙；渦旋混合器；具塞塑料離心管。

圖2.  0.8mg/ml三聚氰胺標樣（上）與酸奶實際樣品（下）重疊譜圖。

試劑與標樣

乙腈為迪馬公司HPLC級乙腈；超純水為經Milli-Q系統凈化處理過的純凈水。

三氯乙酸溶液：準確稱取50g三氯乙酸于1L容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混勻后備用。

氨化甲醇溶液：10mM離子對試劑緩沖液（pH3.0）：準確稱取2.10g檸檬酸和2.16g辛烷磺酸鈉，加入約980ml水溶解，調節pH至3.0后，定容至1L備用。

三聚氰胺標準貯備液：濃度1mg/ml，溶劑為乙腈/水（1：1）。

標準工作液：逐級稀釋三聚氰胺標準貯備液，以流動相定容，制成濃度分別為0.8mg/ml，2.0mg/ml，20.0mg/ml，40.0mg/ml，80.0mg/ml的標準工作液。

樣品制備

稱取2g（精確至0.01g）試樣于50ml具塞塑料離心管中，加入15ml三氯乙酸溶液和5ml乙腈，超聲提取10min，再振蕩提取10min后，以4000r/min離心10min。上清液經濾紙過濾后，用三氯乙酸溶液定容至25ml，精密移取5ml濾液，加入5ml水混勻后做待凈化液。

圖3.  液態奶、0.8ppm標準樣品、液態奶添加8ppm三聚氰胺樣品的色譜圖比較。

將待凈化液轉移至6cc/150mg SampliQ固相萃取柱（小柱事依次先經5ml甲醇、6ml水活化）中。依次用5ml水和5ml甲醇洗滌，抽至近干后，用5ml氨化甲醇溶液（5%）洗脫。整個固相萃取過程流速不超過1ml/min。洗脫液于50℃下用氮氣吹干，殘留物（相當于0.4g試樣）用1ml流動相1定容，渦旋混合1min，過0.2mm微孔濾膜。

RRLC色譜條件

RRLC：ZorbaxSB-C84.6x50mm，1.8mm；

流動相：10mM離子對試劑緩沖液（pH3.0）：乙腈＝92：8；進樣量：8μL；檢測波長為240nm；流速：1.5ml/min；柱溫30℃。

結果與討論

樣品前處理

SPE過程采用安捷倫新近推出的SampliQSCX固相萃取小柱。該小柱使用簡單，重現性良好，對奶粉與液態奶的提取可以獲得穩定和良好的回收率。本實驗中，采用的6cc/150mgSampliQSCX小柱，對液態奶的回收率為90%。本應用亦可選用3cc/60mgSCX小柱進行。

圖4.  某品牌奶粉樣品（下）與0.8ppm標準樣品（上）的譜圖比較。

樣品的液相色譜分析（RRLC）

線性范圍與檢出限：以0.8mg/ml，2.0mg/ml，20.0mg/ml，40.0mg/ml，80.0mg/ml的標準工作液繪制標準曲線，得到線性回歸方程y=17.76x-3.07，相關系數R2=0.99996（圖1）。計算檢出限（三倍信噪比）約為0.03mg/ml。

實際樣品的分析結果：使用現有方法可以良好分析經SPE處理后的奶粉與液態奶實際樣品中的三聚氰胺。一次分析可在6min內完成。其中三聚氰胺保留時間在2.8min，后續時間為清洗雜質的時間。如果需要加快分析速度，可采用2ml/min的流速，以進一步縮短分析時間。

結論

本方法采用SampliQSCX固相萃取小柱、亞二微米的ZORBAXSBC8RRHT反相色譜柱、離子對色譜法可以快速分析奶粉與液態奶中的三聚氰胺。樣品提取與凈化使用了安捷倫公司新近推出的陽離子交換機理的SampliQSCX固相提取小柱，獲得了良好與穩定的回收率結果。分析方法采用最普遍使用的反相色譜方法，色譜柱來源豐富，儀器配置簡單，方法簡便易行，可作為常規三聚氰胺篩查方法使用。分析既可在普通HPLC上進行，亦可在高分離度快速液相色譜（RRLC）上進行，后者可大大提高分離速度。