Southern雜交技術2

三：操作

(一)轉膜

1電泳

2切膠 在紫外下，切取凝膠有條帶部分

3脫嘌啉0.25NHCL浸泡凝膠10分鐘，蒸餾水洗膠（大于15kb的DNA片段轉移時做此步驟）

4變性，變性液（0.5MNaOH、1.5MNaCL）浸泡凝膠2次，每次15分鐘，蒸餾水洗膠

5中和,中和液（0.5Mtris-HCL,pH7.0、3MnaCL）浸泡凝膠2次，每次15分鐘，蒸餾水洗膠

6平衡，凝膠在20×SSC中室溫平衡10分鐘

7轉膜,取一塑料盒,將一干凈玻璃板橫架于盒上，盒中倒入10×SSC，作為轉移緩沖液，將2張大小合適的濾紙用20×SSC溶液浸濕，放置于玻璃板上，作為濾紙橋

將處理好的凝膠切去多余部分并切下一角作標記，膠面反轉放置于濾紙橋上，四周用Parafilm膜封閉，以防短路

剪取一塊面積稍大于凝膠的硝酸纖維素膜（NC膜），以2×SSC溶液浸濕后置于凝膠上

剪取2塊相應大小的濾紙，以2×SSC溶液浸濕后置于NC膜上

（濾紙、凝膠、NC膜、濾紙間都不能有氣泡）

濾紙上面放一疊吸水紙，上面壓一塊玻璃板，再壓上500g左右的重物，轉移過夜

8烤膜，轉移結束后，NC膜在與凝膠切角相對處，用鉛筆做記號，用6×SSC溶液室溫漂洗5分鐘，以充分洗去沾上的凝膠成分，吸水紙吸干殘余液體，室溫晾干，NC膜用濾紙夾裹好，80℃烤膜2小時

9烤干的NC膜用２×SSC浸潤。

注：

1：在７操作中每層間應確保無汽泡存在。

2：操作中吸水紙的大小應小于頂層濾紙，且不能于濾紙下的任何一層接觸。

3：烤片的作用在于使已轉移條帶更牢地結合于NC膜上。

（二）雜交

1封閉，將雜交好的NC膜用濾紙吸干，放入一新雜交袋中，用封閉液４２℃封閉２－４小時（封閉液用量為４ml/50cm2膜）。

2預雜交，將上部浸潤的NC膜裝入雜交袋，加入預雜交液（0.2ml/cm2膜），使膜與預雜交液充分混勻，趕走汽泡，封口。65℃２－４小時。

3雜交，傾出預雜交液，加入雜交液（預雜交液＋臨用前變性的標記好探針，終濃度為1-2ng/ml）（0.2ml/cm2膜），65℃過夜。

4洗膜，用洗滌液Ａ，Ｂ分別洗膜兩次，每次洗膜液體積不少于250ml。

5反應，棄去封閉液，加入親和素－堿性磷酸酶溶液，室溫避光反應１５分鐘，輕輕震蕩。取出膜，用洗滌液Ｃ，Ｄ分別洗滌三次，每次洗滌體積不應少于300ml，每次5分鐘，振蕩。

6顯色，將膜轉入新袋中，加入底物溶液（用量為４ml/50cm2膜）。封袋，避光放置，顯色數分鐘至數小時，以雜交帶清晰，背景低為好。

十五－2:DIG試劑盒雜交實驗

一儀器：同十五－1

二試劑： 變性液：0.5MNaOH、1.5MnaCL

中和液：0.5Mtris-HCL,pH7.0、3MnaCL

20×SSC溶液（同十七－1）

預雜交液：Blocking溶液（試劑盒帶）

雜交液（含5-25ng/ml，DIG標記探針的預雜交液）

low stringence buffer(2×SSC，0.1%SDS)

high stringence buffer(0.5×SSC，0.1%SDS)

洗滌液（0.1M馬來酸，0.15MNaCL,pH7.5,0.3%Tween-20,）

抗體溶液（含1/5000的DIG標記堿磷酶的Blocking溶液）

平衡液（0.1MTris-HCL,0.1MNaCL pH 9.5）

顯色液（平衡液中含2％BCIP/NBT儲存液）

BCIP/NBT儲存液(試劑盒帶)

三：操作

(一)轉膜 同十五－1

（二）雜交

1預雜交，將烤好的NC膜放入一個比膜稍大的塑料袋中，按100cm2/10ml的比例加入適量的預雜交液，趕走氣泡，封口機封口，42℃預雜交30分鐘

2雜交，倒掉預雜交液，按100cm2/10ml加入雜交液，42℃雜交過夜

（三）檢測

1準備好一個塑料盒，放入100mllow stringence buffer，將雜交后的NC膜取出，置于上述溶液中，室溫晃動5分鐘

2取新鮮的low stringence buffer,重復上述操作一次

3將NC膜取出，置于65℃預熱的100ml high stringence buffer,65℃晃動15分鐘

4取新鮮的high stringence buffer,重復操作一次

5將NC膜轉移至塑料盒中，內含洗滌液，室溫晃動2分鐘，倒掉洗滌液。

6加入100mlBlocking溶液，室溫晃動30分鐘，以除去沒有特異結合的探針，倒掉Blocking溶液

7加入20ml抗體溶液，室溫晃動30分鐘，倒掉溶液

8用洗滌液室溫晃動洗滌2次，每次15分鐘，以除去多余的抗體，倒掉洗滌液

9平衡，加入20ml平衡液，室溫放置3分鐘，倒掉平衡液
10顯色，加入10ml顯色液，顯色，目標條帶顯色后用50mlTE終止反應。