Wnt信號通路是一種蛋白質網絡，他們在胚胎發育和癌癥中發揮了重要的作用，同時也參與了成年動物的正常生理過程 （1）調節了轉錄輔助因子β-catenin穩定性和依賴β-catenin基因的表達。（2）有助于理解人類疾病的發生機制，為疾病的治療提供一個新的靶點。
| 實驗方法原理 | 1. Wnt/β-catenin信號轉導通路是一條在生物進化中極為保守的通路。在正常的體細胞中，β-catenin只是作為一種細胞骨架蛋白在胞膜處與E-cadherin形成復合體對維持同型細胞的黏附、防止細胞的移動發揮作用。只有當細胞外Wnt信號分子與細胞膜上特異性受體Frizzled蛋白結合激活胞內的d ishevelled（散亂的）蛋白導致GSK3B失活，使α-catenin避免被磷酸化而遭降解的命運 , β-catenin才能在胞質中積累起來。 2. 當胞質中B-catenin的濃度達到一定水平時， 就可向細胞核轉移。在胞核中β-caten in與轉錄因子家族Tcf /Lefs結合， 可激活cyc linD1 和cmyc等原癌基因而導致細胞的增殖、分化、成熟。顯然， 在這條信號通路中β-catenin 發揮了重要作用，其在胞質中積累繼而向胞核的轉位， 被認為是該信號通路被激活的標志。已有研究證實，Wnt/β-catenin信號通路在人結腸癌、乳腺癌等腫瘤的發生中被激活。并抑制下游蛋白質復合物，包括axin、GSK-3、與APC蛋白。axin/GSK-3/APC 復合體可促進細胞內信號分子β-catenin的降解。當“β-catenin 降解復合物”被抑制后，胞漿內的β-catenin得以穩定存在，部分 β-catenin進入細胞核與TCF/LEF轉錄因子家族作用并促進特定基因的表達。 3. 建立大鼠的肝癌模型，以Wnt/β-catenin 信號通路中的幾個關鍵因子為研究對象， 探討它們在正常鼠肝、不典型增生鼠肝和腫瘤肝臟中的表達，以期揭示Wnt/β-catenin信號轉導通路與肝腫瘤發生的關系，為臨床上肝癌的診治提供新的線索。 |
|---|---|
| 實驗材料 | |
| 試劑、試劑盒 | 兔抗β- caten in抗APC 抗體鼠抗cyclin D1 mAbPV6001兩步法檢測試劑盒總RNA 提取試劑盒PCR 反應試劑盒 |
| 儀器、耗材 | |
| 實驗步驟 | 1. 大鼠肝癌模型的建立 將二已基亞硝胺（ DENA）的水溶液以70 m g /kg的劑量每周灌胃1次， 15周停藥。有10只大鼠在造模過程中死亡，其余32只分別在喂藥后第1、4、6、8、10、12、14、16周，處死動物，每次處死4 只。每只取不同部位的小塊肝組織，分別置于40 g /L 多聚甲醛固定液中固定并液氮凍存。正常對照組8只，不給藥。 2. wnt1、β-catenin、APC、cyc lin D1 及cmyc mRNA 的RT-PCR 檢測 引物的設計和合成交由大連寶信生物公司完成，經驗證后使用。 擴增wnt1 基因的引物序列為： 5-ATCCTG CAC CTG CGA CTA CAG-3和5-GGC GAC TTC TCG AAGTAG ACC-3，擴增產物長度為432 bp，退火溫度為58e 。擴增β-caten in基因的引物序列為： 5-AAG TTC TTG GCT ATTACG ACA-3和5-ACA GCA CCT TCA GCA CTCT-3，擴增產物長度為375 bp, 退火溫度為58. 2e 。 擴增APC 基因的引物序列為： 5-CGG AAC ATG CAT GAC TGA GAC-3 和5-GTC ACGAGG TAC GAC CTC AGAT-3，擴增產物長度為310 bp，退火溫度為60e 。 擴增cy clin D1基因的引物序列為： 5-CAGAAGTGCGAAGCTTAGGTCT-3 和5-GTA GCA GGA GTA GTC CAGCGG-3，擴增產物長度為440 bp， 退火溫度為58e 。 擴增cmyc基因的引物序列為： 5-GGA ACT ATG ACC TCG ACT ACGAC-3和5-ACC ATG TCT CCT ACA GTA GCTC-3，擴增產物長度為186 bp，退火溫度為60. 5e 。 擴增內參照B-actin引物的序列為5-CGT TGA CAT CCG TAA CGA CTCC-3和5-ATA GAGCCA CCA TTC CGA CAC AG-3，擴增產物的長度為665 bp， 退火溫度為60e 。 |
| 注意事項 | 1. 采用多聚甲醛來固定大鼠組織時，固定時間避免太久，否則組化盡出假陽性。把固定時間確定下來，固定好后放低濃度酒精里可以放置時間久一點。 2. 對于取出大鼠小塊肝部位，避免肝的重要部位有鑷子的刮痕，以免對實驗后期的觀察產生影響。 4. 擴增基因序列時，要嚴格按照所設定的溫度進行。 |
| 其他 | 1. Wnt信號通路廣泛存在于無脊椎動物和脊椎動物中，是一類在物種進化過程中高度保守的信號通路。Wnt信號在動物胚胎的早期發育、器官形成、組織再生和其它生理過程中，具有至關重要的作用。如果這條信號通路中的關鍵蛋白發生突變，導致信號異常活化，就可能誘導癌癥的發生。 2. 經文獻報道，研究人員檢查了超過3500份的癌癥樣本，包括結腸癌、黑色素瘤、肝細胞瘤、脊髓母細胞瘤、消化道腫瘤等，發現在超過700個癌癥病例中出現β-Catenin的多種突變。Β-Catenin的N端序列可能是其致癌的關鍵位點，這些位點的突變使得β-Catenin在胞內表達失控，導致Wnt信號異常激活，從而誘發包括結直腸癌、肝母細胞瘤、卵巢癌和前列腺癌等在內的多種癌癥。 |