清華團隊開發基于電噴霧電離技術的冷凍電鏡樣品制備方法

　　生物大分子的三維結構可以直觀地揭示其生物學功能、細胞內進程以及探索其在疾病中發揮作用的方式。冷凍電鏡（cryo-electron microscopy,cryo-EM）單顆粒分析技術通過對生物大分子的直接成像進行高分辨率結構測定，已成為結構生物學的重要研究手段。冷凍電鏡單顆粒分析技術需要對生物大分子溶液的冷凍樣品采集大量電子顯微數據，以進行三維結構解析，因此高質量的冷凍樣品制備在其中起著至關重要的作用。良好的制樣方法需要能夠簡便地、可控地制備出接近理想狀態的生物大分子冷凍樣品。

　　諾貝爾化學獎獲得者雅克·杜博切特（Jacques Dubochet）等人于1984年發明了冷凍樣品制備的濾紙夾置法（Pipet-blot-plunge），至今仍然是冷凍電鏡樣品制備的主要手段。在這種傳統的制樣方法中，研究人員難以精確控制樣品冰層厚度和大分子顆粒分布，導致冷凍樣品的均一性和可重復性較差。越來越多的證據表明，在樣品被冷凍之前的瞬間，生物大分子會吸附在超薄的液體層的氣液界面（Air-water interface, AWI）上，導致生物大分子的顆粒結構損傷、變性或產生優勢取向，減低了高分辨率冷凍電鏡結構分析的效率和成功性。如何獲取可重復的高質量的生物大分子冷凍樣品仍然是冷凍電鏡技術應用中的一個難題。

　　圖1. ESI-cryoPrep方法設計和儀器裝置示意圖

　　4月25日，清華大學生命科學學院王宏偉課題組和精密儀器系歐陽證、周曉煜課題組在《自然·方法學》（Nature Methods）在線發表了題為“電噴霧輔助的冷凍電鏡樣品制備方法用以減輕界面吸附效應”（Electrospray-assisted cryo-EM sample preparation to mitigate interfacial effects）的研究論文。研究采用非變性質譜（Native mass spectrometry, native MS）中廣泛使用的電噴霧電離（Electrospray ionization, ESI）技術，設計并搭建了一種新型冷凍樣品制備裝置ESI-cryoPrep（圖1），成功實現了無需濾紙夾吸的冷凍樣品制備，并獲得了多種生物大分子近原子分辨率的三維結構。

　　研究表明，ESI-cryoPrep可以有效地將生物大分子顆粒完整嵌入無定形態薄層冰中，避免其吸附在空氣-水、固體-水界面上，并對該裝置制備生物大分子冷凍樣品過程中的界面模型進行了機理闡釋。ESI-cryoPrep以“軟”電離技術ESI為基礎，通過向蛋白溶液施加高電壓形成大量帶電的蛋白液滴，可以有效地減少蛋白的變性與碎裂。在電場的驅動下，帶電液滴飛向電鏡載網的過程中伴隨著去溶劑化的進行；液滴表面的電荷密度激增至瑞利極限導致庫侖裂變形成帶電的次級液滴；這一過程循環往復直至液滴最終沉積在電鏡載網上；收集到帶電液滴的電鏡載網被插入液氮冷卻的液態乙烷中即可實現對液滴的快速冷凍。

　　該過程完全省卻了濾紙的夾吸，避免了濾紙材料對液體和生物大分子的影響。因為液滴表面的小分子離子形成了雙電層效應，生物大分子與液體的界面被隔絕開，從而避免了生物大分子吸附到氣液或固液界面上，更好地保持了生物大分子的天然結構。該研究首次對ESI液滴中的生物大分子的天然結構（Native structures）進行了直接測定，指導獲得ESI的“軟著陸”電離參數進行冷凍制樣與非變性質譜分析。該工作是冷凍電鏡與質譜技術的交叉融合，共同致力于解答生物大分子結構解析與分析的科學問題。

　　研究團隊在搭建的設備上，經過多次摸索確定了制備高質量冷凍樣品的相關參數。這些參數既能滿足保存高比例完整結構生物大分子顆粒的需求，又能促進帶電液滴在附著電鏡載網表面的擴展和浸潤。研究團隊運用優化的ESI-cryoPrep裝置制備了五種生物大分子的高質量冷凍樣品，獲得了與目標生物大分子尺寸相對應的理想冰層厚度，并實現了全部測試樣品70Sribosome、20Sproteasome、apo-ferritin、ACE2和streptavidin的高分辨率三維結構解析，分辨率分別為2.7?、2.0?、2.1?、3.3?和1.9?。

　　研究團隊對冷凍電鏡數據進行了深入的挖掘與分析，發現與預期假設一致的結果。ESI-cryoPrep可以有效地將生物大分子顆粒完整嵌入無定形態冰的薄層中間，抑制目標生物大分子在空氣-水或石墨烯-水界面的吸附（圖2），從而避免蛋白質顆粒的結構損傷或者優勢取向問題。研究工作提出了電荷殘留模型，闡明了電噴霧電離產生的液滴表面的電荷不均勻分布保護蛋白質顆粒免于界面吸附的作用和機制。

　　這種學科交叉的研究成果不僅將為冷凍電鏡樣品制備提供應用價值，還將對冷凍電鏡技術和非變性質譜領域的交叉和發展產生積極影響，為更多創新應用開辟新的可能性。自主研發的高質量冷凍電鏡樣品制備裝置，一方面可以縮短結構解析的漫長探索過程，更高效地獲得高分辨三維結構，分析其作用機理；另一方面也提升了原創研發具有自主知識產權和高精尖技術的能力，減少對國外相關儀器和設備的依賴。

　　圖2.ESI-cryoPrep方法制備的冷凍樣品中蛋白質顆粒在斷層成像中的代表性空間分布

　　清華大學生命科學學院2017級博士生楊梓和精密儀器系2018級博士生范菁津（已畢業）為該論文共同第一作者，清華大學生命科學學院教授王宏偉，精密儀器系教授歐陽證和副教授周曉煜為論文共同通訊作者。清華大學生命科學學院王家副研究員和范瀟博士等為課題的啟動和推進作出重要貢獻。研究得到國家自然科學基金、騰訊基金會等的資助，并得到清華大學冷凍電鏡中心和計算中心的技術支持。