“生長曲線”當指揮：難養微生物也能唱“獨角戲”

　　在地球的深海熱泉、濕地，或者動物腸道和沉積物等環境中，生活著一群“無氧居民”——厭氧微生物。他們能分解有機廢物、產生甲烷等可再生能源，還能參與溫室氣體的生成和消減——從污水處理廠到畜禽養殖、從沼氣利用到腸道健康，都離不開它們。

　　然而，人類想要分離得到有益的厭氧微生物，卻很困難——它們異常難養。

厭氧菌的賽跑：誰能跑到終點？微生物分離就像賽跑：紅色桿狀是目標微生物，其他顏色的是“競爭對手”。目標菌在不同“賽道”上可能占據優勢、緩慢勝出。受訪者供圖

　　近日，農業農村部成都沼氣科學研究所（以下簡稱沼科所）厭氧微生物創新團聯合荷蘭瓦赫寧根大學團隊找到了新的辦法。他們利用厭氧微生物的生長曲線當“指揮棒”，利用自創的“雞尾酒法”定向分離產甲烷古菌。相關研究成果在線發表于《微生物趨勢》（Trends in Microbiology）和《自然—試驗流程》（Nature Protocols）。

　　唯厭氧微生物難養也

　　雖然我們不能用肉眼看見它們，但厭氧微生物是全球碳、氮、硫循環的重要驅動者，它們與人類的關系非常密切。

　　論文第一作者、沼科所在讀博士生巫可佳告訴《中國科學報》，這些“無氧居民”對生活條件要求極高——一點氧氣都不能碰，常常需要特定的溫度、酸堿度、營養條件才能進行生長和生存。

　　它們大多生活在濕地、深海、腸道、熱泉等地下缺氧環境中，無法脫離地下缺氧環境，就好像一群“隱居高手”。生長緩慢、數量不多，有些還離不開特定“伙伴”。這些厭氧菌需要與其他微生物互相交換營養物質或代謝產物，通過共培養或者共生才能生存，就像“搭檔關系”，缺了對方就活不下去。

　　這種生存方式使得它們在實驗室環境中非常難以存活，一旦被請進實驗室，就常常悄然消失。

　　如果想要把它們培養成純菌狀態，就更難了。

　　論文通訊作者、沼科所研究員承磊在接受《中國科學報》采訪時說，獲得純培養物，是研究新型微生物的生理功能、代謝功能、生態功能的資源基礎，以及如何利用它們在清潔能源生產、污染治理、健康等方面的能力。

　　傳統的分離方法像是舉辦一場“短跑賽”，要求目標厭氧菌一開始就具備絕對生長優勢，一步到位打敗所有競爭者，這讓許多“慢熱型選手”始終無緣亮相。

　　承磊解釋說，這是因為厭氧菌通常生長慢，生長條件苛刻，容易被“快生長”的非目標菌淹沒。

　　2016年，承磊團隊著手從一份2007年取自我國勝利油田的樣本中分離產甲烷古菌，由于這份樣本對“投喂”的甲醇異常敏感，并且能產生甲烷。承磊團隊認為，這里面可能隱藏著新的產甲烷古菌的生存模式。

　　但是要想搞清楚這里面的厭氧古菌究竟如何產生甲烷，首先要把它從成分復雜的樣本中分離出來。然而，究竟如何讓如此難養的厭氧微生物在實驗室環境中生存并分離？這成為他們迫切想解決的難題。

　　生長曲線當“指揮棒”

　　傳統方法解決不了他們的問題。只能自己想辦法。

　　“我們在多年分離實驗中發現，單一方法往往不夠。”承磊說，因為分離過程中既要保證目標菌的生長，同時又要抑制非目標菌，而一個樣品中的非目標菌是多種多樣的，通常單一的方法很難去除復雜的目標菌，因此需要靈活組合多種“配方”——稀釋、限制養料、加抑制劑……像調制雞尾酒一樣，根據情況調整分離策略來逐步去除不同的非目標菌。

　　巫可佳說，通過定期取樣，用分子生物學方法或者流式細胞計數等方法監測目標菌和其他菌的細胞數量變化，按時間和細胞數量變化畫成生長曲線。

　　他們提出用生長曲線當“指揮棒”，實時觀察目標菌和非目標菌的生長動態。在不同階段創造條件，讓目標菌占據“相對優勢”，或者讓非目標菌對目標菌的抑制更輕微，一步步“請走”非目標菌，直到目標菌能單獨站上舞臺。

　　巫可佳解釋說，把難培養微生物的分離過程為多個階段——先摸清目標微生物的生長“喜好”，再通過稀釋、限制養料、精準抑制等手段逐步減少“陪客”，最后只留下目標微生物。“這套方法的特別之處在于，不要求目標菌一開始就跑得最快，而是通過階段性調整，讓它在不同‘賽段’中都能保持相對優勢。”

　　針對不同類型的非目標菌，他們有不同“招數”：有的改變營養條件（底物、生長刺激因子），有的改變物理化學因子（溫度、pH、鹽濃度等）或者梯度稀釋，有的加抗生素或溶菌酶抑制非目標菌。

　　“我們第一次用多年摸索的方法成功分離到非廣古菌門的新型產甲烷古菌，并通過分離獲得的菌株解析其生理和代謝機制。”承磊所說的這項工作成果2024年7月發表在《自然》雜志。

　　后來，他們總結和提煉了該團隊十多年厭氧微生物分離經驗，形成了“基于生長曲線”和“相對生長優勢”的微生物純培養理念。

　　基于底層邏輯的分離方法

　　“很開心能用這套方法挖掘出新型的產甲烷古菌。”巫可佳說，這是基于分離微生物的底層邏輯入手的——如何從一個復雜的群落中獲得目標菌。一個底層的理念可以適用于微生物生長分離的各個階段，不僅適用于厭氧微生物，同時也適用于好養、兼性厭氧等微生物的分離。“期望未來可以幫助到更多的微生物資源的分離。”巫可佳說。

　　承磊強調，此方法的建立受益于測序技術的發展，這使得人們可以鑒定復雜群落中的目標菌和非目標菌，以達到分離的目的。

　　《微生物趨勢》論文審稿人說，這篇論文關注了一個長期以來被系統性忽視的重要主題。科學界普遍存在偏見，導致大家逐漸形成一種共識：所謂“不可培養”的微生物，是真的無法被培養，或者說付出的努力代價太大，以至于不值得去嘗試。“不可培養”這個說法本身，就暗示了不可能性，從而加劇了這種不幸的局面。

　　“雖然宏基因組學在發現新型微生物方面非常有用，但它在一定程度上也削弱了科學家們繼續開展更費時、更具智力挑戰性的分離培養研究的動力。更為遺憾的是，學界并沒有充分認識到宏基因組信息與分離培養株生理學之間存在的巨大理解鴻溝。”審稿人說，這篇論文引起了大家對這些不足的關注，更重要的是，提出了切實可行的實驗思路來彌補這些缺陷。這是一項“極有價值、恰逢其時、姍姍來遲的重要貢獻”。

　　而《《自然—試驗流程》》審稿人評價，這項研究提出的“生長曲線引導分離”方法非常有趣，為難以培養的古菌分離提供了新的視角。

　　承磊說，如今，這套方法不僅適用于產甲烷古菌，還能推廣到熱泉、深海、動物腸道等多種缺氧環境微生物的分離培養。他們實驗室已經從熱泉和油藏等特殊環境分離了多株難培養微生物。

　　承磊希望它成為難養厭氧微生物分離的通用策略，還可結合人工智能和高通量平臺進行微生物的大規模高效定向分離，幫助科學界“解鎖”更多隱藏在自然界的微生物角色，豐富人們對地球生命的認識，為氣候研究、能源開發和環境保護等研究提供新菌種資源。

　　相關論文信息：https://doi.org/10.1038/s41596-025-01224-x