重磅|華大智造首度公開旗下測序儀文庫構建核心序列

　　2018年9月8日，在華大基因集團19周年慶前夕，華大智造首次向業內公開華大智造測序儀文庫構建核心序列，致敬華大基因集團。華大智造成立于2016年，一直致力于研發和生產基因測序設備。如行業內小伙伴們所知，華大智造已擁有四款高通量測序儀——BGISEQ-500、BGISEQ-50、MGISEQ-2000和MGISEQ-200獲得國家食品藥品監督管理總局醫療器械認證，成為國內唯一世界唯三, 能夠量產臨床級別測序儀的企業。那么，華大智造的測序儀到底有怎樣的優勢，今天小編就帶著大家去深入了解一下MGI測序儀的技術原理。

　　（文末可下載華大智造測序儀文庫構建核心序列）

　　一、MGI測序儀核心技術全解析

　　華大智造現有的BGISEQ/MGISEQ系列測序儀都采用了微陣列DNA納米球測序技術(DNBseq技術)，通過超高密度微陣列芯片和PCR-free DNA納米球技術(DNB, DNA Nanoballs)的整合可以實現高精準基因測序。BGISEQ/MGISEQ測序儀上的測序流程和其他測序平臺一樣，也可以將數據產出分成三個環節——樣本制備、樣本加載和測序分析。樣本制備主要是為了DNA或RNA加上BGISEQ/MGISEQ測序儀所需特殊接頭形成可測序文庫；樣本加載主要是將可測序文庫轉換成為DNA納米球并加載至微陣列芯片上，在BGISEQ-50和MGISEQ-200測序儀上這一過程已經自動化整合在測序分析流程中；測序分析就是將DNA納米球上序列信息逐一采集形成基因測序數據。

　　圖1 華大智造測序平臺全流程

　　下面針對樣本制備、樣本加載及測序分析各個環節還有詳細解析。

　　樣本制備

　　文庫制備主要分為五個環節: 片段化-末端修復及添加A尾-接頭連接-PCR擴增-單鏈成環(圖2) 。

　　針對DNA樣本，首先可以通過超聲儀器或打斷酶對DNA進行片段化，根據文庫大小可以選擇不同片段化條件獲得預期長度的小片段DNA。打斷后的片段DNA兩端會有缺口，需要對DNA缺口進行修復并同時完成5’端磷酸化和3’端添加A尾。連接上帶BGISEQ/MGISEQ測序儀特有接頭后，進行PCR擴增得到DNA文庫。以上步驟是常規建庫中常規步驟, 在BGISEQ/MGISEQ測序儀，為了獲得DNA納米球，還需要將DNA文庫中的雙鏈產物進行單鏈變性、環化、消化得到可用于制備DNA納米球的單鏈環狀DNA，即單鏈環化步驟。

　　圖2 華大智造測序平臺WGS建庫流程

　　針對血漿游離DNA樣本，由于提取獲得核酸已經是片段化DNA，因此不需要進行片段化，整體建庫時間不到3.5小時。針對RNA樣本，需要去除rRNA或進行mRNA富集，并進行反轉錄形成DNA文庫。除了以上常規樣本之外，miRNA、甲基化和單細胞測序等都已開發了對應樣本制備處理方法。

　　由于DNA納米球的制備是在液體系統中進行，因此華大智造測序儀樣本制備全流程可以在自動化工作站完成，目前華大智造自主開發的自動化建庫平臺上已經實現十余種的建庫流程。

　　樣本加載

　　樣本加載主要可以分為兩個環節: DNB制備和DNB加載(圖3)。

　　單鏈環狀DNA文庫通過滾環擴增技術（RCA, Rolling Circle Amplification），得到的擴增產物即DNA納米球。采用這種線性滾環等溫擴增技術，每個擴增循環都以原始的單鏈環狀DNA為模板，能保持每次模板擴增的獨立性。因此，即使擴增過程中出現堿基錯配，也不會被累積，保證最高的擴增保真度。

　　將制備好的DNB加載到微陣列芯片（Patterned Array）上，這一過程稱為DNB加載。Patterned Array技術是通過先進的半導體精密加工工藝，在硅片表面形成陣列和對準標記，保證芯片表面的活化位點精準排布，每個活化位點結合一個DNB，實現了DNB的規則排列吸附，提高了測序芯片的利用效率。

　　圖3 DNB制備和加載

　　測序分析

　　DNB加載后芯片可裝載到測序儀上進行測序，華大智造測序平臺使用優化的聯合探針錨定聚合技術（cPAS, Combinatorial Probe-Anchor Synthesis），將測序引物錨定分子和熒光探針在DNA納米球上進行聚合反應之后，利用高分辨成像系統對光信號進行采集、讀取和識別獲得單個堿基序列信息，然后進行下一個循環獲得下一個堿基序列信息。如此經過單端或雙端50-150次循環后，最后經算法將堿基序列信息組合成為完整DNA序列。

　　圖4 華大智造測序平臺cPAS技術原理

　　二、MGI測序儀產出數據特點

　　基于上面文庫構建和數據產出流程, 到目前為止在BGISEQ/MGISEQ測序儀上產出數據達到10Pb以上，發表文章超過100篇, 在這里也簡單總結BGISEQ/MGISEQ系列測序儀上產出數據特點:

　　 高準確性: PCR-free DNB使用的滾環擴增技術，使得擴增模板始終不變，擴增錯誤不會累積，與PCR指數擴增相比有保真優勢，在進行Indel檢測上具有顯著性優勢。 (更多數據揭秘需要持續關注）

　　 低Adapter Rate： BGISEQ/MGISEQ測序儀采用單鏈環化DNA文庫，其制備過程中殘留的接頭由于沒有環化而被消化掉，使得華大智造測序平臺有著超低的adapter rate，一般情況下低于0.5%。

　　 低Duplicate Rate： 基于納米球測序技術的BGISEQ/MGISEQ系列芯片上的活化位點與DNB納米球的大小一致，使芯片位點只能結合一個DNB納米球。因此，BGISEQ/MGISEQ測序儀產出Duplicate Rate只在3%以下。（點擊了解更多Duplicate Rate知識：https://mp.weixin.qq.com/s/VX-ewxGcxe3_NLB_Tx6h0Q）

　　 “0” Index Hopping： 華大智造測序平臺獨特的文庫構建技術和單鏈環狀文庫滾環擴增技術使得index hopping發生概率遠低于其他測序平臺，僅采用單barcode就可將Index Hopping發生概率控制在0.0001%~0.0004%。（點擊了解更多Index Hopping知識：https://mp.weixin.qq.com/s/Dvh0LC8eDy_R2Y_Lpgp0YQ）

　　看到這里，是不是想把自己的新想法、新技術和新產品在BGISEQ/MGISEQ測序儀上測試呢? 為了讓大家可以實踐自己的想法，華大智造已經正式開放BGISEQ/MGISEQ系列測序儀上的核心序列信息，歡迎各位同行下載交流。