| 實驗步驟 |
材料
緩沖液和溶液
貯存液，緩沖液和試劑的成分請參閱附錄 1。
將貯存液稀釋到合適的濃度。
10x 退火緩沖液
200 mmol/LTris-Cl(pH7.5)
100 mmol/LMgCl2
500 mmol/LNaCl
10X 合成緩沖液
100 mmol/L Tris-Cl (pH7-5)
dTTP、dATP、dCTP、dGTP 每種濃度為 5 mmol/L
10 mmol/LATP
20 mmol/LDTT
酶和緩沖液
噬菌體 T4DNA 連接酶
噬菌體 T4DNA 聚合酶或測序酶
噬菌體 T4 編碼的天然 DNA 聚合酶不能從模板 DNA 上置換寡核苷酸引物 (Nossal 1974.Kunkel 1985,Bebenek and Kunkel 1989,Schens 1989)。
單一位點的限制性內切核酸酶
凝膠
1% 的瓊脂糖凝膠（含 0.5ug/ml 溴化乙錠）
核酸和寡核苷酸
誘變引物
選擇引物
誘變引物和選擇引物一定要能退火成靶
DNA 的同一鏈，每條引物的 5'端一定要磷酸化。誘變引物設計見信息欄中有關誘變寡核苷酸專題。突變應位于引物的中間，突變位點兩側帶有
10~15 個能與模板DNA 完全配對的堿基。寡核苷酸引物在使用前用高壓液相色譜（HPLC) 或聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE) 純化（請見第
10 章，方案 1 或 5)。幾個公司（Clomech;Pharmacia) 銷售選擇引物，某些公司（例如 Pharmacia)
也銷售成對的"toggle」引物，它們可用于限制位點正向或反向轉變，容許有序的多輪突變. 而不需亞克隆模板。
質粒 DNA
可通過商業銷售的樹脂進行柱層析或堿裂解法進行閉和環狀質粒 DNA 的純化（請見第 1 章，方案 2 或 9)。
培養基
LB 瓊脂平板和含合適抗生素的 LB 液體培養基
專用設備
70°C 水浴和適合限制酶消化反應溫度的水浴
其他試劑
本方案步驟 7 和 14 需要的試劑列在第 1 章方案 23、24 或 26 中，大腸桿菌轉化見方案 26。
本方案步驟 10 和 16 中少量制備質粒 DNA 需要的試劑列在第 1 章方案 1 中。
本方案步驟 17 所需的試劑列在第 12 章方案 3、4、5 中。
載體和菌株
請見附錄 3
帶 mutS 表型（例如，BMH71-18) 的轉化用大腸桿菌感受態
帶 mut+表型的轉化用大腸桿菌感受態
請見步驟 14。
方法
突變 DNA 鏈的合成
1. 在微量離心管中混合以下物質:
10x 退火緩沖液 2ul
質粒 DNA 0.025 至 0.25pmole
選擇引物 25pmoles
突變引物 25pmoles
加水至 20ul
沸水中孵育 5 min。
質粒 DNA 用量取決于反應中使用的引物和質粒 DNA。
2. 將離心管立即置于冰上冷卻 5 min。微型離心機上離心 5s，使液體集中到離心管底部。
3. 將以下成分加入到含退火引物和質粒 DNA 的離心管中：
10X 合成緩沖液 3ul
噬菌體 T4DNA 聚合酶 （2~4 單位/ul) 1ul
噬菌體 T4DNA 連接酶（4~6 單位/ul) 1ul
水 5ul
用移液器溫和的上下吹打幾次將試劑混勻。在微型離心機上離心 5S, 使液體集中到離心管底部。37°C 孵育反應 1~2 h。
4.70°C 加熱離心管至少 5 min, 滅活酶并終止反應。將離心管放置在實驗臺上冷卻至室溫。
通過限制性內切核酸酶消化進行初篩
5. 將 NaCl 的濃度調節到適合單一位點限制酶反應的濃度。使用 10X 退火緩沖液,NaCl 貯存液，或限制酶提供的 10x 緩沖液。
在總體積為
30ul 的合成或連接混合物中，NaCl 濃度為 37.5 mmol/L。如果限制消化反應不需要 NaCl 或需要低于上述濃度的 NaCl,
可用乙醇沉淀合成連接緩沖液中的 DNA 混合物，或將 DNA 混合物通過一個懸浮在合適限制酶緩沖液中的離心柱。
6. 將 20 單位選用的限制性內切核酸酶加入到反應混合物中。在合適的溫度下消化至少 1 h。
重要：反應中的酶體積（包括聚合酶和連接酶）不應超過總反應體積的 10%。應按照以上比例相應地調節反應體積。
突變質粒的第 1 輪轉化與富集
7. 按照第 1 章方案 23~26 所述的轉化程序，用消化混合物中包含的質粒 DNA 轉化如 BMH71-18 的 mutS 大腸桿菌菌株。
8. 用 10,50 和 250ul 轉化混合物涂布含適當抗生素的 LB 瓊脂平板上。37°C 孵育培養皿過夜。在培養皿孵育期間進行步驟 9。
這些培養皿被用于測定轉化子的數量。每 50ul 轉化混合物涂布的培養皿應產生 100~300 個克隆。
9. 加入 3 ml 含適當抗生素的 LB 培養液至剩余的轉化混合物中以擴增質粒。37°C 振蕩培養過夜。
10. 第二天從大約 2.5 ml 的過夜培養物中制備質粒 DNA(請見第 1 章方案 1)。
11. 用選擇的限制酶消化步驟 10 制備的質粒 DNA。
質粒 DNA 500ng
10x 限制酶緩沖液 2ul
單-位點的限制性內切酶 20ul
加水 至 20ul
在適當溫度中孵育反應 2 h。
12. 再加入 10 單位的限制酶，孵育至少 1h。
13. 取 5~10ul 質粒 DNA 經 1% 的瓊脂糖凝膠（含 0.5ug/ml 溴化乙錠）電泳，通過凝膠電泳評估消化結果。
未被消化的（環狀的）DNA
經凝膠電泳分離成兩條帶，它們分別對應于松弛形的環狀形式或超螺旋形式 DNA。線性化的質粒 DNA 呈現與環狀 DNA
不同的條帶。然而，由于親本質粒占總質粒 DNA 的絕大多數，對應于未被消化的突變體質粒 DNA 的帶與被消化的親本質粒 DNA
帶相比可能相當微弱。
最后一輪轉化
14. 取 2~4ul 消化的質粒 DNA(大約 50~100ng), 轉化化學方法處理的大腸桿菌 mutS+菌株，或用滅菌水對 1ul 質粒 DNA 進行 5 倍稀釋（約 5ng)，電擊法轉化大腸桿菌 mutS+菌株（請見第 1 章方案 23~26)。
15. 分別取 10、50 和 250ul 轉化混合物涂布含適當抗生素的 LB 瓊脂平皿。37°C 孵育培養皿過夜。
16. 第 2 天，至少挑取 12 個單獨的轉化子進行小量質粒 DNA 制備，用限制性內切核酸酶消化，瓊脂糖凝膠電泳，鑒定對抗選擇性限制性內切核酸酶消化的質粒。
17.DNA 序列分析確定含預定突變的質粒（請見第 12 章方案 3、4、5)。
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