痘苗病毒儲液制備
實驗方法原理 實驗材料 懸浮培養的 HeLa S3 細胞痘苗病毒試劑、試劑盒 完全 MEM-10 和 MEM-2.50.25 mg ml 胰酶儀器、耗材 Sorvall H-6000A 轉子150 cm2 組織培養瓶CO2 培養箱實驗步驟 1. 用血細胞計數器對懸浮培養的 HeLa S3 細胞進行細胞計數。2. 將 5×105 個細胞室溫 1800 g，離心 5 min，棄上清。3. 將細胞懸浮于 25 ml 37℃ 完全 MEM-10 培養基中，放入 150 cm2 組織培養瓶中，將其放入 5% CO2 加濕培養箱中 37℃ 培養過夜。同樣，也可使用 150 cm2 組織培養瓶中貼壁培養的單層細胞（見「細胞培養實驗」基本方案 1），直接進行步驟 4。4. 在使用前，將一定體積的痘苗病毒儲液與 0.25 mg/ml 胰酶混合，渦旋混勻。在 37℃ 水浴鍋中保溫 30 min， 并在保溫過程中每隔 5～10 min 渦旋混......閱讀全文
痘苗病毒儲液制備
基本方案 噬斑分析測定滴度 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 實驗材料 懸浮培養的 HeLa S3
痘苗病毒儲液制備
實驗材料懸浮培養的 HeLa S3 細胞痘苗病毒試劑、試劑盒完全 MEM-10 和 MEM-2.50.25 mg ml 胰酶儀器、耗材Sorvall H-6000A 轉子150 cm2 組織培養瓶CO2 培養箱實驗步驟1. 用血細胞計數器對懸浮培養的 HeLa S3 細胞進行細胞計數。2. 將 5×
痘苗病毒儲液制備
實驗方法原理 實驗材料 懸浮培養的 HeLa S3 細胞痘苗病毒試劑、試劑盒 完全 MEM-10 和 MEM-2.50.25 mg ml 胰酶儀器、耗材 Sorvall H-6000A 轉子150 cm2 組織培養瓶CO2 培養箱實驗步驟 1. 用血細胞計數器對懸浮培養的 HeLa S3 細胞進行細
痘苗病毒儲液制備——噬斑分析測定滴度
實驗方法原理經胰酶作用的系列稀釋病毒儲液常被用于感染適當的細胞系。經過幾天的培養后，吸出培養基，將細胞用結晶紫染色。由于感染細胞變縮、變圓和脫落，形成直徑 1～2 mm 顏色較淡的噬斑。實驗材料生長良好的貼壁培養的單層 BSC-1 細胞病毒儲液試劑、試劑盒0.1% 結晶紫（溶于 20% 乙醇）儀器、
MVA－病毒儲液制備實驗
實驗材料成片 CEF 或 BHK-21 細胞改造的痘苗病毒試劑、試劑盒MEM-10 和 MEM-2.5 完全培養基儀器、耗材150 cm2 組織培養瓶CO2培養箱Sorvall 離心機250 ml 無菌離心瓶實驗步驟1. 用 1.5 ml 胰酶/EDTA 加 8.5 ml 的維持培養基消化 7 瓶
MVA－病毒儲液制備實驗
實驗方法原理 實驗材料 成片 CEF 或 BHK-21 細胞改造的痘苗病毒試劑、試劑盒 MEM-10 和 MEM-2.5 完全培養基儀器、耗材 150 cm2 組織培養瓶CO2培養箱Sorvall 離心機250 ml 無菌離心瓶實驗步驟 1. 用 1.5 ml 胰酶/EDTA 加 8.5 ml
MVA－病毒儲液制備實驗
基本方案 免疫染色法滴度測定 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 實驗材料 成片 CEF 或 BHK-
桿狀病毒儲液制備實驗
實驗方法原理 實驗材料 懸浮培養的 Sf 9 細胞待接種的桿狀病毒（野生型的或重組）試劑、試劑盒 含10％胎牛血清的昆蟲細胞培養液 TNM-FH儀器、耗材 150 mm 培養瓶 27℃ 培養箱 倒置顯微鏡 帶有 GH-3.7 水平轉子的4℃GPR離心機 帶螺口蓋的凍存管 液氮罐 500 ml 旋轉細
桿狀病毒儲液制備實驗
基本方案 從懸浮培養中制備 基本方案 從單層培養中制備 噬斑試驗測定滴度 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 實驗材料
桿狀病毒儲液制備實驗——從單層培養中制備
實驗材料單層培養的 Sf 9 細胞待接種的桿狀病毒（野生型的或重組）試劑、試劑盒含10％胎牛血清的昆蟲細胞培養液 TNM-FH儀器、耗材150 mm 培養瓶27℃ 培養箱倒置顯微鏡帶有 GH-3.7 水平轉子的4℃GPR離心機帶螺口蓋的凍存管液氮罐500 ml 旋轉細胞培養瓶多轉瓶的攬拌臺實驗步驟1
桿狀病毒儲液制備實驗——從懸浮培養中制備
實驗材料懸浮培養的 Sf 9 細胞待接種的桿狀病毒（野生型的或重組）試劑、試劑盒含10％胎牛血清的昆蟲細胞培養液 TNM-FH儀器、耗材150 mm 培養瓶27℃ 培養箱倒置顯微鏡帶有 GH-3.7 水平轉子的4℃GPR離心機帶螺口蓋的凍存管液氮罐500 ml 旋轉細胞培養瓶多轉瓶的攬拌臺實驗步驟1
痘苗病毒純化實驗
大規模純化 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 對于很多研究，部分純化的病毒就足夠了（進行到本實驗步驟 14）， 如果是純化 MVA 病毒，則不能用胰酶消化，也不能用 CEF 細胞
痘苗病毒純化實驗
實驗方法原理 對于很多研究，部分純化的病毒就足夠了（進行到本實驗步驟 14）， 如果是純化 MVA 病毒，則不能用胰酶消化，也不能用 CEF 細胞或 BHK-21 細胞代替 HeLa 細胞。實驗材料 痘苗病毒儲液HeLa S3 細胞（懸浮培養）試劑、試劑盒 胰酶Tris ? Cl蔗糖儀器、耗材 旋轉
痘苗病毒純化實驗
痘苗病毒通常采用蔗糖密度梯度離心的方法純化。純化的病毒可用于制備痘苗病毒 DNA ，用于不允許存在感染細胞蛋白污染的研究中，同時也可以用作高滴度的病毒儲液。對于大規模的純化（至少 1 L 的培養物），最好的方法是用 HeLa 細胞懸液作為感染的對象，而不要用單層培養的細胞。內容來源于《精編分子生物學
桿狀病毒儲液制備實驗——噬斑試驗測定滴度
實驗材料對數生長期單層培養的 Sf 9 細胞試劑、試劑盒桿狀病毒儲液昆蟲細胞培養液儀器、耗材瓊脂糖頂層覆蓋物臺盼藍頂層覆蓋物（選用）60 mm 組織培養皿27℃ 培養箱1.5 ml 帶螺口蓋的凍存管實驗步驟1. 用含 10％ 胎牛血清的 TNM-FH 培養液稀釋處于對數生長期的 Sf 9 細胞至約
痘苗病毒DNA提取實驗
基本方案 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 實驗材料 純化的痘苗病毒
痘苗病毒DNA提取實驗
實驗方法原理 實驗材料 純化的痘苗病毒試劑、試劑盒 Tris?Cl 溶液SDS蔗糖溶液 蛋白酶 K用 50 mmol／L Tris ? Cl 溶液平衡的苯酚1：1苯酚氯仿1 mol／L 乙酸鈉乙醇儀器、耗材 分光光度計Sorvall 離心機實驗步驟 1. 在 260 nm 處確定純化的疸苗病毒的光密
痘苗病毒DNA提取實驗
如果提取的痘苗病毒DNA用于轉染，則應在蛋白酶 K 消化和苯酚抽提后分離。具體方法見本實驗。實驗材料純化的痘苗病毒試劑、試劑盒Tris?Cl 溶液SDS蔗糖溶液蛋白酶 K用 50 mmol／L Tris ? Cl 溶液平衡的苯酚1：1苯酚氯仿1 mol／L 乙酸鈉乙醇儀器、耗材分光光度計Sorval
MVA－病毒儲液制備實驗——免疫染色法滴度測定
實驗方法原理MVA 病毒滴度通常是用免疫染色法進行測定，因為 MVA 不能在 CEF 或 BHK-21 細胞中形成噬斑。實驗材料CEF 或 BHK-21 細胞MVA病毒儲液試劑、試劑盒MEM-10 和 MEM-2.5 完全培養基1:1 丙酮／甲醇PBS（含和不含3% FBS兩種）PBS／H2O2兔抗
痘苗病毒系統基因表達實驗
重組痘苗病毒（VTF7-3）感染后的脂質體轉染 兩種重組痘苗病毒共感染細胞 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 本方案從構建外源基因位于 PT7 和 T7 終止子之間的質
痘苗病毒系統基因表達實驗
實驗方法原理 本方案從構建外源基因位于 PT7 和 T7 終止子之間的質粒載體開始，然后用重組質粒通過脂質體介導轉染已經被vTF7-3（可以持續表達T7 RNA聚合酶的痘苗病毒）感染的細胞。收獲后，基因產物在細胞內的表達可以用脈沖標記的方法或用「重組痘苗病毒及其產物的鑒定實驗」中敘述的方法分
痘苗病毒系統基因表達實驗（一）
本節介紹依賴于在哺乳動物細胞質合成噬菌體 T7 RNA 聚合酶的瞬時細胞質表達系統。首先，將感興趣的基因插入質粒中，使其位于 T7 RNA 聚合酶啟動子（PT7）的控制下。應用脂質體轉染，重組質粒進入感染了 vTF7-3 的細胞質中，而 vTF7-3 是一種能編碼噬菌體T7 RNA聚合酶的重組痘苗病
T7RNA聚合酶系統基因表達實驗
實驗方法原理 含有 pT7 控制的外源基因（「痘苗病毒系統基因表達實驗」中「重組痘苗病毒（VTF7-3）感染后的脂質體轉染」）的重組質粒，通過同源重組可整合到痘苗病毒中,并制備重組病毒儲液。將此病毒儲液與 vTF7-3 共同感染貼壁或懸浮細胞，在培養過程中，外源基因被高效的 T7 RNA
T7RNA聚合酶系統基因表達實驗
兩種重組痘苗病毒共感染細胞 單病毒感染OST7-1細胞 利用VOTE系統 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 含有 pT7 控制的外源基因（「痘苗病毒系統基
T7RNA聚合酶系統基因表達實驗（一）
本節介紹依賴于在哺乳動物細胞質合成噬菌體T7 RNA聚合酶的瞬時細胞質表達系統。首先，將感興趣的基因插入質粒中，使其位于T7 RNA聚合酶啟動子（PT7）的控制下。在培養過程中，外源基因被高效的 T7 RNA聚合酶轉錄。這種轉染方案適用于分析的目的，因為不需要構建新的重組病毒，所以比較簡單。對于大規
T7RNA聚合酶系統基因表達實驗（三）
實驗方法原理VOTE是最近發展的痘苗病毒/T7 RNA聚合酶混合表達系統，將外源基因克隆到質粒 pVOTE. 1或 pVOTE. 2 中，通過同源重組將其整合到痘苗病毒 vT7lacOI 基因組中，制備重組病毒儲液。在異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）存在的條件下，用重組病毒感染細胞，外源基因
痘苗病毒系統基因表達實驗（二）
實驗方法原理含有 pT7 控制的外源基因（本實驗「重組痘苗病毒（VTF7-3）感染后的脂質體轉染」）的重組質粒，通過同源重組可整合到痘苗病毒中,并制備重組病毒儲液。將此病毒儲液與 vTF7-3 共同感染貼壁或懸浮細胞，在培養過程中，外源基因被高效的 T7 RNA 聚合酶轉錄，并在感染細胞的細胞質完成
痘苗載體轉染細胞實驗——CaCl2－法
實驗方法原理將感興趣的外源基因亞克隆到質粒轉移載體上，外源基因的兩端為痘苗病毒基因組非必需基因片段。隨后，將重組質粒轉染病毒感染的細胞，痘苗病毒基因組與質粒上同源的部分發生同源重組。應用適當的篩選方案，經幾輪噬斑純化，從細胞裂解物中獲得重組病毒。實驗材料pSCll／pRB21／pSC65／pLW9
痘苗載體轉染細胞實驗
實驗方法原理 將感興趣的外源基因亞克隆到質粒轉移載體上，外源基因的兩端為痘苗病毒基因組非必需基因片段。隨后，將重組質粒轉染病毒感染的細胞，痘苗病毒基因組與質粒上同源的部分發生同源重組。應用適當的篩選方案，經幾輪噬斑純化，從細胞裂解物中獲得重組病毒。實驗材料 pSCll／pRB21／pSC65／pLW
痘苗載體轉染細胞實驗
CaCl2 法 DOTAP 法 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 將感興趣的外源基因亞克隆到質粒轉移載體上，外源基因的兩端為痘苗病毒基因組非必需基因片段。隨后，將重組質