質粒的轉化及轉化子的鑒定實驗
實驗方法原理 熱激法：大腸桿菌在0 ℃ CaCl2低滲溶液中，菌細胞膨脹成球形，轉化混合物中的DNA形成抗DNase的羥基－鈣磷酸復合物粘附于細胞表面，經42 ℃短時間熱沖擊處理，促進細胞吸收DNA復合物，在豐富培養基上生長數小時后，球狀細胞復原并分裂增殖。在被轉化的細胞中，重組子基因得到表達，在選擇性培養基平板上可挑選所需的轉化子。實驗材料 外源片段與載體的連接產物大腸桿菌感受態細胞試劑、試劑盒 X-galAmpLA培養基水抗生素儀器、耗材 培養皿滅菌鍋離心管搖床實驗步驟 1. l ml X-gal (20 mg/ml)，25 ml Amp（100 mg/ml），250 ml制備選擇性培養基平板：在融化的250 ml LA培養基中250 mI PTG (200 mg/ml)，混勻后倒入滅菌培養皿中；2. 取出3管制備好的感受態細胞，放在冰上融化；3. 每100 μl感受態細胞加入約2......閱讀全文
大腸桿菌感受態細胞的制備及轉化
實驗概要? ? ? ? 獲得感受態細胞；制備含有目的片段的克隆。實驗原理?在自然條件下，很多質粒都可通過細菌接合作用轉移到新的宿主內，但在人工構建的質粒載體中，一般缺乏此種轉移所必需的mob基因，因此不能自行完成從一個細胞到另一個細胞的接合轉移。如需將質粒載體轉移進受體細菌，需誘導受體細菌產生一種短
釀酒酵母的LiAc/ssDNA/PEG高效轉化法實驗_轉化含有質粒菌株
實驗材料細胞試劑、試劑盒YPAD儀器、耗材培養瓶SC 減樣選擇培養基實驗步驟1. 在一個 250 ml 的培養瓶中，接種該菌株到 25 ml 相應的 SC 減樣選擇培養基中，200 r/min 培養過夜。2. 檢測每毫升細胞數，按 2.5X108?個細胞計算所需培養物體積。3. 將該體積的培養物加到
弱化子的功能特點
弱化子(attenuator)是指原核生物操縱子中能顯著減弱甚至終止轉錄作用的一段核苷酸序列，該區域轉錄產物能形成不同的二級結構，利用原核微生物轉錄與翻譯的偶聯機制對轉錄進行調節。
弱化子的功能介紹
弱化子(attenuator)是指原核生物操縱子中能顯著減弱甚至終止轉錄作用的一段核苷酸序列，該區域轉錄產物能形成不同的二級結構，利用原核微生物轉錄與翻譯的偶聯機制對轉錄進行調節。
感受態細胞的制備和轉化
第一節 概 述?在自然條件下,很多質粒都可通過細菌接合作用轉移到新的宿主內,但在人工構建的質粒載體中,一般缺乏此種轉移所必需的mob基因,因此不能自行完成從一個細胞到另一個細胞的接合轉移。如需將質粒載體轉移進受體細菌,需誘導受體細菌產生一種短暫的感受態以攝取外源DNA。轉化(Transformati
重組DNA的轉化實驗原理和操作步驟
實驗目的制備出感受態細胞，把體外重組的DNA引入受體細胞，使受體菌具有新遺傳性，并從中選擇出轉化子。實驗原理感受態就是細菌吸收轉化因子的生理狀態，只有發展為感受態的細胞才能穩定攝取外來的DNA分子。pUC18的LacZ基因區域當有DNA片段插入時，LacZ基因失活，轉化進入大腸桿菌并在含有IPTG和
大腸桿菌轉化實驗時的注意點
有時候第一天涂的轉化平板、次日早晨轉化子可能長成的菌落比較大（1~2毫米以上，BL21就長得快），下一步轉化子做質粒鑒定。這個情況下可以直接挑取一塊菌苔（勿帶出培養基），50微升酚/氯仿懸浮菌體，放置兩分鐘，加40微升TE抽提，上層TE吸出后再氯仿抽提一次，吸取上層TE即是質粒提取液。提取的質粒可以
酵母菌基因克隆實驗
實驗材料?酵母菌實驗步驟 1.? 用含LEU 2作為選擇標志的酵母菌DNA文庫轉化lea 2 cdc 101-1酵母菌株，在23℃培養，依據插入片段的大小，篩選2 000~20 000個Leu+轉化體。?2.? 影印平板轉化體，將其轉印到預熱的選擇性平板，并于37℃培養篩選互補溫感突變的表型。過
酵母菌基因克隆實驗——互補法
實驗材料酵母菌實驗步驟1. ?用含LEU 2作為選擇標志的酵母菌DNA文庫轉化lea 2 cdc 101-1酵母菌株，在23℃培養，依據插入片段的大小，篩選2 000~20 000個Leu+轉化體。?2. ?影印平板轉化體，將其轉印到預熱的選擇性平板，并于37℃培養篩選互補溫感突變的表型。過夜培養之
畢赤酵母PEG1000轉化方法
實驗概要本文介紹了畢赤酵母PEG1000轉化方法。據稱PEG比LiCl 方法好，但不如去壁細胞及電轉化法，但對沒有電轉裝置的人來說，更方便，效率為102-103/ugDNA。主要試劑Buffer A：1M山梨醇，10mM bicine(N－二(羥乙基)甘氨酸)pH8.35，3%(v/v)乙二醇Buf
革蘭氏陽性細菌的轉化
一、革蘭氏陽性細菌，轉化過程的幾個階段： 1.細菌感受態的形成 由于分泌一種稱為感受態因子的小蛋白而導致細菌感受態的形成。 2.轉化因子的吸收雙鏈DNA片段與感受態受體菌的細胞表面特定位點結合，并激活臨近的核酸酶。DNA雙鏈中的一條單鏈逐步降解，同時另一條單鏈逐步進入細胞 3.整合復合物前體的形成
革蘭氏陽性細菌的轉化
?一、革蘭氏陽性細菌，轉化過程的幾個階段：?1.細菌感受態的形成?由于分泌一種稱為感受態因子的小蛋白而導致細菌感受態的形成。?2.轉化因子的吸收?雙鏈DNA片段與感受態受體菌的細胞表面特定位點結合，并激活臨近的核酸酶。DNA雙鏈中的一條單鏈逐步降解，同時另一條單鏈逐步進入細胞。?3.整合復合物前體的
質粒DNA高頻轉化大腸桿菌實驗——高頻法
實驗材料感受態細胞試劑、試劑盒質粒DNA抗生素儀器、耗材Ep管水浴鍋LB平板實驗步驟1、取新制備的一管感受態細胞。?2、取0．03 ml感受態細胞轉和4 ng質粒DNA混勻，置冰浴30min?3、將 Ep管置于42 ℃水浴中熱沖擊2分鐘，立即置于冰上1分鐘。?4、在 Ep管中加70 ul LB培養基
提高質粒DNA的轉化效率方法有哪些
1.細胞生長狀態和密度:不要用經過多次轉接或儲于4℃的培養菌，最好從-70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉接用于制備感受態細胞的菌液。細胞生長密度以剛進入對數生長期時為好，可通過監測培養液的OD600來控制。DH5α菌株的OD600為0.5時,細胞密度在5×107個/ml左右(不同的菌株情況有所不
大腸桿菌感受態制備與質粒轉化
主要試劑1、LB培養基（滅菌后使用）胰蛋白胨（bacto-tryptone） 10g/L酵母提取液（bacto-yeast extract） 5 g/LNaCl 10g/L用NaOH調pH至7.0。2、LB固體平板每升液體培養基中加入15g瓊脂粉，高壓滅菌后倒入滅過菌的培養皿中。3、SOC培養基20
相互作用蛋白鑒定實驗——相互作用蛋白捕獲
實驗方法原理實驗要經過兩次連續大量的酵母菌平板篩選過程。酵母菌含有 LexA 融合探針、報道基因和插入PJG4-5（見圖19.1.6）的 GAL 啟動子控制下的 cDNA 表達文庫。最近，已有可供用于這個系統的文庫。實驗材料攜帶適當質粒組合的酵母菌試劑、試劑盒完全（CM）缺失成分液體培養基含有如下指
一些分子生物學實驗小技術匯編
1．保存菌種保存菌種或長時間放置的培養板應先劃板活化菌種，挑取分隔良好的單 克隆接種于2-10 ml ＬＢ中（如菌種含質粒則應加抗生素）３７攝氏度快搖 ８小時，按0.1%-0.5% 比例轉種，培養基的量不應超過錐瓶的0.25容量，以 保證足夠的通氣。用O.D.600 測菌密度時，讀數值在0.1-0.
一些分子生物學實驗小技術1
1．保存菌種保存菌種或長時間放置的培養板應先劃板活化菌種，挑取分隔良好的單 克隆接種于2-10 ml ＬＢ中（如菌種含質粒則應加抗生素）３７攝氏度快搖 ８小時，按0.1%-0.5% 比例轉種，培養基的量不應超過錐瓶的0.25容量，以 保證足夠的通氣。用O.D.600 測菌密度時，讀數值在0.
重組質粒（dna－recombinant－plasmid）的連接、轉化及篩選2
第二節 材料、設備及試劑一、 材料外源DNA 片段: 自行制備的帶限制性末端的DNA 溶液,濃度已知; 載體DNA : pBS質粒(Ampr ,lacZ),自行提取純化,濃度已知; 宿主菌: E. coli DH5α,或JM系列等具有α-互補能力的菌株。二、 設備恒溫搖床，臺式高速離心機，恒溫水浴鍋
綠色熒光蛋白在轉質粒后在細胞可以發光多久
1. 綠色熒光蛋白GFP只要蛋白不降解,熒光不會萃滅.若做穩定表達,那就可以隨時觀察熒光,但做穩定表達時程很長;若做瞬時表達,在轉染后48小時左右應該就有GFP表達,可以觀察熒光.
感受態細胞的保存方法
轉移1.6 mL的感受態細胞懸浮液至已消過毒的冷藏管內，并加入已滅菌的0.4 mL甘油使最終濃度達到20%，混勻。甘油儲液可在- 4 ℃，- 20 ℃和- 70 ℃下分別儲存待用 。轉化效率按下公式計算:轉化效率(cfu·μg -1)=(每皿轉化子平均數×菌懸液稀釋倍數) 質粒微克數。實驗涉及的一般
基因克隆的基本步驟有哪些
基因克隆的基本步驟流程如下：一、目的DNA片段的獲得：DNA克隆的第一步是獲得包含目的基因在內的一群DNA分子，這些DNA分子或來自于目的生物基因組DNA或來自目的細胞mRNA逆轉錄合成的雙鏈 cDNA分子。由于基因組DNA較大，不利于克隆，因此有必要將其處理成適合克隆的DNA小片段，常用的方法有機
2011轉化醫學高峰論壇在滬舉行
2011轉化醫學高峰論壇今日（6月11日）在上海市第六人民醫院舉行。“中國科學院上海生命科學研究院與上海第六人民醫院代謝性疾病轉化醫學基地”及“上海市第六人民醫院骨科轉化醫學中心”揭牌。 據介紹，“轉化醫學”是醫學研究的一個分支，旨在為基礎研究與臨床醫療之間建立更直接的聯系。近三年來
酵母功能互補實驗
實驗概要本實驗將在構建了大蒜重金屬抗性基因表達載體并轉入大腸桿菌DH5α的基礎上，選擇鑒定準確的質粒轉化酵母細胞，對轉化子進行了PCR鑒定和RT-PCR分析，及重金屬抗性實驗。主要試劑YPD培養基，醋酸鋰，PEG(50%)，乙醇，少量酵母菌總RNA快速抽提試劑盒主要設備搖床，離心機，水浴鍋，PCR儀
質粒DNA的大量提取、純化及棉花的遺傳轉化
實驗試劑1. STE [0.1 mol/L NaCI、10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0), 1 mmol/LEDTA (pH 8.0)]2. 溶液I [50 mmol/L蔗糖、25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0), 10 mmol/L EDTA (pH8.0)]
質粒DNA的大量提取、純化及棉花的遺傳轉化
實驗試劑1. STE [0.1 mol/L NaCI、10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0), 1 mmol/LEDTA (pH 8.0)]2. 溶液I [50 mmol/L蔗糖、25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0), 10 mmol/L EDTA (pH8.0)]
質粒DNA的大量提取、純化及棉花的遺傳轉化
實驗試劑1. STE [0.1 mol/L NaCI、10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0), 1 mmol/LEDTA (pH 8.0)]2. 溶液I [50 mmol/L蔗糖、25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0), 10 mmol/L EDTA (pH8.0)]
重組質粒（dna－recombinant－plasmid）的連接、轉化及篩選1
第一節 概 述質粒具有穩定可靠和操作簡便的優點。如果要克隆 較小的DNA 片段(＜10kb)且結構簡單,質粒要比其它任何載體都要好。在質粒載體上進行克隆 ,從原理上說是很簡單的，先用限制性內切酶切割質粒DNA 和目的DNA 片段, 然后體外使兩者相連接, 再用所得到重組質粒轉化細菌,即可完成
質粒DNA的大量提取、純化及棉花的遺傳轉化
實驗概要本實驗從轉化農桿菌中大量提取質粒DNA并純化，利用離體子房注射法將外源基因導入棉花，獲得轉基因棉花。主要試劑1. STE [0.1 mol/L NaCI、10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0), 1 mmol/LEDTA (pH 8.0)]2. 溶液I [50 mmol/L蔗
感受態細菌轉化時需要多大的質粒濃度
100-500ng/uL。質粒轉化不少于10的5次方，連接產物不少于10的6次方。兩種質粒是可以同時進入同一個感受態細胞的，比如構建腺病毒載體時。但是要求兩種質粒進入同一個感受態細胞，轉化效率非常低，一般需要電轉或者其他的特殊處理。增加收菌次數，相對提高了質粒的量，這樣的話裂解液的量可以適當增加；裂