研究揭示天然免疫中caspase活化分子機理

　　2月27日，中國科學院生物物理研究所王大成/丁璟珒研究組和北京生命科學研究所邵峰研究組合作，在國際學術期刊《細胞》在線發表題為Structural Mechanism for GSDMD Targeting by Autoprocessed Caspases in Pyroptosis 的研究論文。該研究完整地揭示了天然免疫應答中caspase精確地自剪切活化，進而特異地識別和切割GSDMD，引發細胞焦亡的分子機制。

　　細胞焦亡是機體重要的天然免疫反應，在拮抗和清除病原菌感染中發揮關鍵作用，過度的細胞焦亡會誘發包括敗血癥在內的多種炎癥性疾病。2015年邵峰團隊的一項重要工作，是發現天然免疫中細胞焦亡是通過活化的半胱氨酸蛋白酶caspase-1和caspase-4/5/11切割共同的底物蛋白GSDMD而引發（Shi et al.， Nature 2015）。隨后王大成/丁璟珒研究組與邵峰團隊合作，進一步證明GSDMD是細胞焦亡的執行蛋白，活化的caspase切割GSDMD蛋白N端和C端結構域的連接區，釋放具有結合膜磷脂上膜打孔活性的N端結構域，進而破壞細胞膜引發細胞焦亡（Ding et al.， Nature 2016）。然而，天然免疫中caspase在響應上游信號后如何活化，活化的caspase又是如何特異地識別和切割GSDMD的精確分子機制仍然不清楚，這也是細胞焦亡研究的關鍵科學問題。

　　Caspase-1和caspase-4/11屬于保守的半胱氨酸蛋白酶caspase家族，該家族因在細胞凋亡通路中發揮關鍵作用而被廣泛研究，caspase以非激活的酶原形式存在于細胞質中，在響應上游信號后通過分子內或分子間的剪切形成由大亞基p20和小亞基p10組成的異源二聚體而激活。研究人員進一步發現LPS激活的caspase-4同樣會發生分子內自剪切，和caspase-11的特異性自剪切發生在p10亞基的N端所不同，caspase-4的自剪切會同時發生在p20亞基的C端以及p10亞基的N端兩個位點。進一步突變實驗發現，只有發生在p10亞基的N端保守的自剪切對于caspase-4的活化以及GSDMD的切割至關重要。

　　傳統上對caspase蛋白酶的一個重要的認識，是其通過識別底物蛋白中具有xxxD（D為天冬氨酸，x為其它氨基酸）序列特征的四肽并在D后切割肽鍵實現對底物蛋白的活化，不同caspase對四肽序列的選擇性偏好不同從而具有不同的底物識別譜。不同于細胞凋亡通路中的caspase會切割多種底物蛋白，GSDMD是caspase-4/5/11目前已知的唯一生理底物，caspase-1除了共享GSDMD作為底物以外，只能切割IL-1β/18兩種細胞因子幫助其成熟和分泌。因此識別四肽的特征很難解釋天然免疫中這些caspase狹窄的底物識別譜。研究人員隨后意外地發現caspase-4/11特異地識別GSDMD蛋白的C端結構域而不是切割位點的四肽序列。在此基礎上，研究人員成功地測定了自剪切激活形式的caspase-4/11與GSDMD的C端結構域復合物的晶體結構，三維結構清晰地揭示了caspase-4/11的p20/p10異源二聚體進一步通過二聚化形成四聚體，在四聚體的界面上形成一個分子間的β折疊，這個β折疊獨立于caspase的半胱氨酸活性中心，伸展向四聚體的外部，像一把鑰匙插入到GSDMD C端結構域的一個疏水口袋中，由于活化的caspase四聚體具有兩個對稱的分子間β折疊，因此caspase-4/11和GSDMD的C端結構域形成了一個2：2狀態的酶-底物復合物。復合物的分子界面也很好地解釋了p10 N端的延長會導致與GSDMD C端結構域的結構沖突，因此活化的caspase需要在p10 N端發生精確的自剪切才能獲得GSDMD識別與切割的能力，這與功能研究的結果一致。基于結構設計的定點突變實驗進一步證明三維結構揭示的保守作用方式就是活化的caspase-4/11特異地識別和切割GSDMD介導細胞焦亡的分子基礎。隨后研究人員進一步通過生化和細胞實驗，以及caspase-1和GSDMD C端結構域復合物晶體結構的解析，證明了自剪切活化的caspase-1采用和caspase-4/11完全相同的方式，通過特異地識別GSDMD的C端結構域來實現對底物GSDMD的切割和活化。

　　這項系統的研究工作，在國際上首次揭示了天然免疫中caspase自剪切活化和特異地識別GSDMD介導細胞焦亡的完整分子機理，也是caspase從發現至今首次獲得與生理底物復合物的三維結構，為caspase酶活機制和底物識別機制研究提供了全面深入的理解。具有重要生理功能的caspase一直都是重要的潛在藥物靶標，但是由于caspase酶活中心具有很高的保守性，因此針對某一caspase開發的抑制劑很難具有高度特異的選擇性。這項研究發現的獨立于酶活中心的全新底物識別位點，為針對caspase和GSDMD開發自身炎癥性疾病和敗血癥的藥物提供了一個重要的新方向。