體外重組（invitrorecombination）
載體與外源DNA分子體外重組時，如何選擇優化連接條件以達到最高的重組率。因此有必要根據影響連接效率的因素綜合考慮連接條件。影響連接效率的因素很多，如反應溫度、插入片段和載體之間的摩爾比、DNA末端性質、反應時間、ATP濃度等。1. 反應溫度是比較重要的影響因素。因為連接酶的最適反應溫度為37℃，但在此溫度下僅含4-6bp的退火粘末端之間的氫鍵結合不穩定（Tm≤15℃），不足以抵抗拒熱運動的破壞，因此連接溫度應介于酶的最適溫度和粘末端退火溫度之間，一般為4-22℃，平末端連接溫度要更低些。退火粘末端之間的連接可視為分子內的連接，而平末端之間為分子間的連接。從分子動力學角度講，后者更為復雜，且速度也要慢得多，因此平末端的連接效率要低一些為粘末端連接效率的1/10-1/100。一般采用如下組合：粘端連接反應16℃12小時或22℃4-5小時，平端連接反應4-8℃12小時。2. 插入片段和載體之間的摩爾比經驗值一般為3-10， 即插入......閱讀全文
體外重組（in－vitro－recombination）
載體與外源DNA分子體外重組時，如何選擇優化連接條件以達到最高的重組率。因此有必要根據影響連接效率的因素綜合考慮連接條件。影響連接效率的因素很多，如反應溫度、插入片段和載體之間的摩爾比、DNA末端性質、反應時間、ATP濃度等。1. 反應溫度是比較重要的影響因素。因為連接酶的最適反應溫度為37℃，
體外重組的定義
中文名稱體外重組英文名稱in vitro recombination定 義在體外對生物的遺傳物質或人工合成的基因進行改造或重新組合形成新的核酸分子或新的基因的手段。應用學科生物化學與分子生物學（一級學科），方法與技術（二級學科）
體外DNA重組技術6
六、重組質粒的轉化【實驗目的】學習和掌握感受態細胞的制備方法和轉化實驗的基本操作。【實驗原理】將重組質粒轉入大腸桿菌的過程稱為轉化。轉化所用的大腸桿菌需要用物理或化學方法特殊處理，使重組DNA分子容易進入細胞內，被處理后易于接納DNA分子的細胞稱作感受態細胞。下面介紹感受態細胞的制備。【實驗試劑與器
體外DNA重組技術5
（三）DNA酶切片段的回收【實驗方法與步驟】1.凍融法:（1）在UV燈下，用手術刀片將含DNA片段的瓊脂糖凝膠切下，-70℃冷凍至少 15min，然后在65℃水浴中使膠融化；（2）加入等倍體積TE-飽和酚，劇烈振蕩30秒鐘，然后-70℃冷凍 15min；（3）室溫融化后，12,000rpm離心5mi
體外DNA重組技術2
【注意事項】基因組DNA分子量大，所有操作必須輕柔，酚/氯仿對皮膚有腐蝕作用，應該戴手套操作。二、RNA的制備【實驗目的】1.理解生物細胞中RNA制備方法的原理。2.熟悉組織細胞中RNA制備的基本操作。（一）細胞總RNA的提取1.異硫氰酸胍法【實驗原理】異硫氰酸胍法提取細胞總RNA是目前常用的提取方
體外DNA重組技術4
（二）質粒的大量制備:1.將5ml轉化菌種接種于500ml LB培養液(含用于篩選的抗生素)中，37℃以225rpm速度振蕩培養12～16小時；2.10,000rpm，4℃離心15min收集菌體；3.將細菌懸浮于100ml預冷的STE（0.1M NaCl，10mM Tris.Cl，pH8.0，1mM
體外DNA重組技術1
在體外將兩個或多個來源相同或不相同的DNA片段連接成新的重組DNA分子，再轉到特定宿主細胞中進行自主復制并表達。這是分子生物學中的基本技術。DNA重組技術的基本程序包括：（1）獲得外源DNA：外源DNA是進行DNA重組的目的DNA片段，一般采用 DNA聚合酶鏈式反應(PCR)或逆轉錄-DNA聚合酶鏈
體外DNA重組技術3
【實驗試劑與器材】（1）Oligo(dT)纖維素（2）層析柱裝置（3）1×上樣緩沖液：20mM Tris.Cl (pH7.6)，0.5M NaCl，1 mM EDTA.Na2 (pH8.0)，0.1%十二烷基肌氨酸鈉(SLS)配制方法: 用Tris.HCl、NaCl和EDTA母液，加入各成分確切
化學所發表ATP合酶體外重組綜述文章
以天然生物活性分子為基元，利用分子組裝策略構建新型的仿生體系，模擬生命基本單元的結構與功能，能有助于在分子層面上理解與認知生物活動的本質與物理化學機制，已發展成為組裝生物學的研究新方向。 ATP合酶是自然界中最小的生物分子馬達，在生物能的產生和轉化方面起著關鍵作用。生命活動所必需的能量三磷酸腺
體外診斷試劑中重組人血清白蛋白的應用
體外診斷（In Vitro Diagnosis，IVD）是指將血液、體液、組織等樣本從人體中取出，使用體外檢測試劑、儀器等對樣本進行檢測與校驗，按照方法學分為生化診斷、免疫診斷、分子診斷三大類。體外診斷市場容量非常大，其中免疫診斷中的化學發光技術因其有高靈敏度、寬的線性范圍、精確的定量檢測、結果穩定
帕金森體外模型帕金森體外模型
體外培養的中腦多巴胺能神經元MPTP損傷模型l實驗操作：實驗采用胚胎齡14一16天的大鼠，剖子宮取胎，取胎鼠中腦腹側區。可將多個胚胎來源的組織收集在一起，置Fl2培養基（Gibco）至35mm的培養皿中，以細剪刀剪碎。將2ml含0.125％的胰酶的F12加入到組織中，該混合物于37oC孵育10分鐘后
基因重組和DNA重組區別
基因重組是由于不同DNA鏈的斷裂和連接而產生DNA片段的交換和重新組合，形成新DNA分子的過程。 在人類的生殖細胞中發現的46條染色體發生在生物體內基因的交換或重新組合。基因重組是生物遺傳變異的一種機制，包括同源重組、位點特異重組、轉座作用和異常重組四大類。DNA重組指DNA分子內或分子間發生的遺傳
關于DNA重組的重組修復介紹
有絲分裂和減數分裂期間由各種外源因子（例如紫外線，X射線，化學交聯劑）引起的DNA損傷都可以通過同源重組修復機制（HRR）來修復。 人類和嚙齒動物中減數分裂期間HRR所必需的基因產物的缺陷會導致不育 。人類HRR所必需的基因產物（例如BRCA1和BRCA2）的缺陷同時會增加患癌癥的風險。在細菌
DNA重組
目的：簡單介紹了DNA重組技術的一些方法。包括重組質粒、PCR等。包括細胞結構、DNA，DNA如何改點等。
關于基因重組的自然重組的介紹
自然界不同物種或個體之間的基因轉移和重組是經常發生的,它是基因變異和物種進化的基礎。自然界的基因轉移的方式有： 接合作用：當細胞與細胞、或細菌通過菌毛相互接觸時,質粒DNA就可從一個細胞（細菌）轉移至另一細胞(細菌）,這種類型的DNA轉移稱為接合作用（conjugation ）。 轉化作用（
位點特異重組的重組機制介紹
位點特異性重組本質上是兩個重組位點的四股DNA發生兩次切割和兩次連接的過程，所需的關鍵成分是重組酶（ recombinase），此外還需要一些蛋白因子。這里以入噬菌體DNA與大腸桿菌DNA整合而進入溶原狀態為例，介紹位點特異性重組機制（圖2-33）。 1．第一次切割重組酶（又稱入噬菌體整合酶，
體外轉錄
·?????????In Vitro RNA Transcription?(Promega)For?in vitro?preparation single-stranded RNA probes or microgram quantities of defined RNA transcripts f
關于位點特異重組的重組效應簡介
位點特異性重組既可以發生在一個DNA分子中，也可以發生在兩個DNA分子間。重組酶識別位點有方向性，所以重組時兩個重組位點的排列有方向性。 1．插入 當位點特異性重組發生在兩個閉環DNA之間或一個閉環DNA與一個線性DNA之間時，重組的結果是DNA插入（即整合），并且插入之后在兩端形成同向重復序
siRNA體外轉染——GenMuteTM－siRNA體外轉染的優化
GenMuteTM siRNA轉染試劑（Cat#SL100568）是市場上最有力的siRNA傳遞工具之一。最佳的siRNA濃度范圍是1.0nM到10nM，過多的siRNA可能導致沉默效果差的“洪水效應”。我們實驗室已經使用GenMuteTM轉染試劑成功敲除了內源表達的生長因子。以24孔板為例，如下步
重組體配子
中文名稱重組體配子英文名稱recombinant gamete定 義遺傳物質發生重組后形成的配子。應用學科遺傳學（一級學科），細胞遺傳學（二級學科）
重組DNA轉化
目的：在體外連接組裝而成的重組DNA分子只能轉入合適的受體細胞，才能大量地進行復制、增殖和表達。通過實驗學會重組DNA轉化的最基本的操作以及如何提高轉化效率的基本思路。?原理：帶有外源DNA片段的重組體分子在體外構建成后，需要導入適當的宿主細胞內進行繁殖或表達出具有一定生物活性的蛋白。能夠作為重組體
DNA重組技術
連接反應的策略?? 可以采用幾種策略來進行外源ＤＮＡ片段和質粒載體的連接。對此，可依據外源ＤＮＡ片段未的性質，以及質粒載體與外源ＤＮＡ上限制酸切位點的性質來作出選擇。（一）外源ＤＮＡ片段未的性質帶有各種未的外源ＤＮＡ的克隆方法見下表：────────────────────────────────
什么體外消化試驗？
體外消化試驗即是在實驗室模擬某些動物體消化道環境，用待測酶制劑進行體外消化飼料等動物食品，并測定消化前后各營養成分(干物質、蛋白質、氨基酸、有機物質、淀粉及纖維素等)的消化率，以判定酶制劑的消化效果。進行體外消化試驗有一定的難度，因為動物消化道內環境是一個動態變化的復雜環境，它受到很多因素(包括動物
體外培養的概念
中文名稱體外培養英文名稱in vitro culture定 義將活體結構成分（如活體組織、活體細胞、活體器官等）甚至活的個體從體內或其寄生體內取出，置于類似于體內生存環境的體外環境中生長和發育的方法。應用學科細胞生物學（一級學科），細胞培養與細胞工程（二級學科）
DNA重組（DNA－recombination）技術：DNA重組與鑒定3
當多克隆位點有外源DNA片段插入時，破壞此酶的N端閱讀框架，產生無α互補功能的N端片段，因此在帶有外源DNA片段的細菌在含有IPTG/X-gal的培養基上呈白色，見圖7-11 。如果外源DNA插入片段相當短，不破壞β-半乳糖苷酶的氨基端氨基酸序列的閱讀框，有時產生的重組體菌落不呈白色而是呈淺藍色。4
DNA重組（DNA－recombination）技術：DNA重組與鑒定1
重組DNA是在體外用限制性內切酶，將不同來源的DNA分子進行特異地切割，獲得的目的基因或DNA片段與載體重新連接，從而組成一個新的DNA雜合分子。重組的DNA分子能夠通過一定的方式進入相應的宿主細胞，在宿主細胞中進行無性增殖，獲得大量的目的基因或DNA片段，此過程稱基因克隆。重組的DNA分子也能夠在
DNA重組（DNA－recombination）技術：DNA重組的載體3
在作為載體時，這些噬菌體有一個很大的優點，即克隆到M13mp載體的外源DNA片段（雙鏈），在子代噬菌體便成為了單鏈形式。故應用M13mp進行克隆，可方便地分離到大量含有外源DNA某一單鏈的DNA分子。這種單鏈DNA可在下列工作中作模板：①主要用作雙脫氧鏈終止法進行DNA序列測定的模板；②制備僅有一條
DNA重組（DNA－recombination）技術：DNA重組的載體2
二、噬菌體載體作為細菌寄生物的噬菌體，大多數具有編碼多種蛋白質的基因，能利用宿主細胞的蛋白質合成體系，進行生長和增殖。構建的噬菌體載體，以λ噬菌體、M13和粘粒最為常用。㈠ λ噬菌體載體野生型λDNA是一種基因組為4.8 kb的線性雙鏈DNA，全部序列已知，共編碼50多個基因。其中約一半基因參與
DNA重組（DNA－recombination）技術：DNA重組的載體1
載體（vector）是攜帶靶DNA（目的DNA）片段進入宿主細胞進行擴增和表達的運載工具。常用的載體是通過改造天然的細菌質粒、噬菌體和病毒等構建而成。目前已構建成的載體主要有質粒載體、噬菌體載體、病毒載體和人工染色體等多種類型，亦可根據其用途不同分為克隆載體和表達載體二類。載體的構建和選擇應考慮以下
DNA重組（DNA－recombination）技術：DNA重組與鑒定2
（1）CaCl2處理以后的轉化: 當細菌處于0℃、二價陽離子（如Ca2+、Mg2+等）低滲溶液中時，細菌細胞膨脹成球形，處于感受態；此時轉化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復合物粘附于細胞表面，重組DNA在42℃短時間熱沖擊后吸附在細胞表面，在豐富培養基中生長數小時后，球狀細胞恢復原